[发明专利]一种检测甲基丙二酸血症致病基因突变的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测甲基丙二酸血症致病基因突变的试剂盒，包括以下成分：MMACHC基因第1到第4外显子编码区PCR扩增与测序引物4对、MUT基因第1到第13外显子编码区PCR扩增与测序引物15对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂。本发明的试剂盒用于检测甲基丙二酸血症致病基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断，降低甲基丙二酸血症的发病率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测甲基丙二酸血症致病基因突变的试剂盒。

背景技术

甲基丙二酸血症(MMA)是一种常见的有机酸血症，甲基丙二酸是异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、胆固醇和奇数链脂肪酸分解代谢途径中甲基丙二酰辅酶A的代谢产物，正常情况下在MCM及VitB12的作用下转化生成琥珀酸，参与三羧酸循环。MCM缺陷或

代谢障碍导致甲基丙二酸、丙酸、甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，引起神经、肝脏、肾脏、骨髓等多脏器损伤。其患病率国外报道的约为1/30 000～1/50 000，国内患病率尚不清楚，但对临床疑似患儿进行串联质谱检测发现，甲基丙二酸血症患儿并不少见。

甲基丙二酸血症患儿临床表现各异，往往易于误诊，最常见的症状和体征是反复呕吐、嗜睡、惊厥、运动障碍、智力及肌张力低下。根据酶缺陷的类型分为MCM缺陷及其辅酶钴胺素代谢障碍两大类。MCM又分为无活性者为mut0型，有残余活性者为mut-型。辅酶钴胺素代谢障碍包括：腺苷钴胺素合成缺陷，即线粒体钴胺素还原酶缺乏(cblA)和钴胺素腺苷转移酶缺乏(cblB)；以及3种由于胞浆和溶酶体钴胺素代谢异常引起的腺苷钴胺素(AdoCbl)和甲基钴胺素(MeCbl)合成缺陷(cblC、cblD和cblF)，这3种类型患者除有甲基丙二酸血症外，还伴有同型半胱氨酸血症，是中国甲基丙二酸血症患者中常见类型。根据维生素B12负荷试验，即连续三天肌内注射VitB12 1mg/d，若症状好转，生化异常改善，为VitB12有效型，无改善者则为无效型。cblC、cblD、cblF型患儿多为VitB12有效型，cb1A、cb1B型部分有效。其中cblC型患儿最常见，主要表现为巨幼红细胞贫血、生长障碍及神经系统症状。早发型多于1岁内起病，迟发型多在4岁以后出现症状，可合并多系统损害。cblD型患儿发病较晚，无血液系统异常表现。cblF型患儿新生儿期出现口腔炎、肌张力低下和面部畸形，部分有血细胞形态异常。VitB12无效型是MMA新生儿期发病最常见的类型，多由于变位酶缺陷引起。出生时可正常，但迅速进展为嗜睡、呕吐并有脱水，出现代谢性酸中毒、呼吸困难、肌张力低下并发脑病。mut0型患儿比其他类型更早出现症状，80％出生第一周发病。

控制该病发生的基因较多，主要有以下四个，分别为：MUT、MMAA、MMAB和MMACHC。这四个基因的突变会造成不同的临床类型。目前主要针对MMACHC基因(占MMA合并同型半胱氨酸的比例为90％)，MUT基因(占单纯MMA的比例为70％)进行基因检测，为甲基丙二酸血症的临床诊断提供技术支持。

发明内容

为了解决上述背景技术中所提到的问题，提供了一种检测甲基丙二酸血症致病基因突变的试剂盒，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断，降低甲基丙二酸血症的发病率。

一种检测甲基丙二酸血症致病基因突变的试剂盒，包括以下成分：

(1)MMACHC第1到第4外显子编码区PCR扩增与测序引物4对，各对引物序列见表1；MUT第1到第13外显子编码区PCR扩增与测序引物15对，各对引物序列见表2，其中，MUT第13号外显子设计了3对引物进行扩增；

(2)PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂为高保真快速PCR扩增试剂，如FastHiFidelity Polymerase、5×Fast HiFidelity PCR Buffer等；

(3)PCR产物纯化试剂，如琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等；