[发明专利]一种植物介导的沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi载体及其应用

权利要求书

1.一种植物介导的沉默小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的RNAi载体，其特征在于：选用小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK的384 bp序列作为靶标序列，构建植物表达RNAi载体，所述的靶标序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

制备方法，具体包括以下步骤：

（1）提取小菜蛾RNA，反转录为cDNA，以该cDNA为模板，扩增精氨酸激酶基因PxAK全长，并插入克隆载体pEASY-blunt中获得重组克隆载体pEASY-PxAK；所述重组克隆载体pEASY-PxAK其插入序列PxAK的Genbank登入号为HQ327310.1；

（2）在小菜蛾精氨酸激酶基因PxAK内选择了一个长为384 bp的保守区域，PCR扩增该序列，且在克隆序列两端添加用于Gateway同源重组的序列attB₁和attB₂；

（3）利用Gateway同源重组技术将该靶标序列片段与植物表达载体pHellsgate-4反应，使靶标序列片段以正反两个方向分别插入载体中，其中两个序列片段之间包含一个PDK内含子序列，由CaMV 35S启动子启动，T-OCS终止子终止表达，具有真核卡那霉素抗性和原核壮观霉素抗性；从而获得可以表达PxAK靶标序列片段dsRNA的植物表达RNAi载体，命名为pHells-dsAK载体；所述pHells-dsAK载体其结构如图1所示；

步骤（1）中采用的扩增引物对为PxAKF：5’- ATG GTG GAC GCT GCA ACT CTT G -3’；PxAKR：5’- TTA CAG GGA CTT CTC GAT CTT GAT GAG C -3’；

步骤（2）中采用的扩增引物对为attB₁-AKF：5’- ggg gac aag ttt gta caa aaa agcagg ctc a - GCC AAC GCT TGC CGC TTC TGG -3’； attB₂-AKR：5’- ggg gac cac tttgta caa gaa agc tgg gtc – GAT GTC GTA CAC GCC GCC CTC -3’。

2.一种如权利要求1所述的RNAi载体的应用，其特征在于，利用农杆菌转化法将pHells-dsAK载体转化拟南芥，获得可以表达PxAK靶标序列dsRNA，且对小菜蛾具有抗性的转基因拟南芥。