[发明专利]一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒通过双抗体夹心法检测人GR的含量，所述试剂盒包括包被板、校准品、结合抗体、酶结合物、质控品、显色剂A、显色剂B、终止液和浓缩洗涤液；

所述包被板包被有GR包被抗体，所述GR包被抗体来源于第一GR抗原，所述第一GR抗原是通过使人GR抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的，所述结合抗体是由第二GR抗原制备而成的，所述第二GR抗原是通过使所述人GR抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的；

所述人GR抗原表位肽(1)和(2)的氨基酸序列分别为：

(1)Tyr Glu Leu Gly Ala Arg Ala Ala Val Val Glu Ser His;

(2)Tyr Glu Lys Val Val Gly Ile His Met Gln Gly Leu Gly。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述GR包被抗体浓度为0.4ng/L，所述结合抗体为0.2ng/L的兔抗人GR多抗，所述酶结合物为HRP标记的羊抗兔IgG，其浓度为1ng/L。

3.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液，所述显色剂A和显色剂B的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为25倍浓缩的磷酸缓冲液，所述终止液为2M H₂SO₄溶液。

5.根据权利要求1所述的一种定量检测谷胱甘肽还原酶的ELISA试剂盒，其特征在于：所述质控品和校准品来自于人体血清，所述质控品的浓度为100ng/L，所述校准品的浓度梯度为120ng/L、80ng/L、40ng/L、20ng/L、10ng/L、0ng/L。

6.一种使用权利要求1-5任意一项所述的试剂盒检测谷胱甘肽还原酶的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）洗涤液的配制：将20ml浓缩洗涤液加入500ml的容量瓶中，再加入480ml蒸馏水，振荡使浓缩洗涤液充分溶解；

2）将试剂盒平衡至室温后，将所需的微孔条取出固定于板架上，编好顺序；

3）加样：先加入50ul 待测样本/GR校准品/GR质控品，再加入50ul GR结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，设空白孔；

4）温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

5）洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

6）加酶：每孔加入两滴或100ul的GR酶结合物，空白孔不加；

7）温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；

8）洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；

9）显色：每孔加入显色剂A、B溶液各一滴或各50ul，充分混匀，置37℃温育15分钟；

10）终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；

11）测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD值；

12）质量控制：如果GR最高浓度校准品OD≥0.8，试验结果为有效；

13）结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以双对数拟合绘制校准曲线，通过待测样本的OD值可在校准曲线上查出其对应浓度值。