[发明专利]一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法

权利要求书

1.一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法，该方法包括如下步骤：

1)提取待鉴定样品的DNA；

2)第一次PCR扩增：以步骤1)提取的DNA为模板，使用ITS 4/5通用引物对进行PCR扩增；

所述ITS 4/5通用引物对为：

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS 5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；

3)第二次PCR扩增：以对步骤2)的PCR产物为模版，以多重位点特异性PCR引物对分别进行PCR扩增，

所述多重位点特异性PCR引物对：

引物对1的序列为：

BX-F：GCTGCTACATCCCTTCCCA

BX-R：GAGCGACCGTGCCGTTA

引物对2的序列为：

HZ-F：TACGGAAGTGCGACAGTCTCATT

HZ-R：TGATGGTTCACGGGATTCTGC

引物对3的序列为：

BY-F：GATTGCGGGATGCGGAGAA

BY-R：TCAGATGGTCGGGTTCCTCACT；

4)对步骤3)的PCR扩增产物进行电泳，检测出620bp条带的待测样品鉴定为半夏，检测出346bp条带的待测样品鉴定为虎掌，检测出167bp条带的待测样品鉴定为鞭檐犁头尖，而其他易混品无上述扩增条带。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中：

步骤1)对样品进行DNA提取，提取方法如下：

1)粉碎：用75％乙醇对样品表面消毒，将样品切成小块，再用高通量组织研磨仪研磨成粉末状；

2)去淀粉和多糖：取粉碎后样品100～150mg，加0.8-1.2mL核分离液混匀，低速离心，重复多次至离心后的核分离液澄清；

3)水浴裂解：沉淀加800μLCTAB液和20μLβ-巯基乙醇混匀，65℃水浴2～4小时，期间反复颠倒混匀多次；

4)抽提：冷却至室温，加800μL Tris平衡酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，离心，取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀，离心；

5)沉淀：取上清加入异丙醇混匀，-20℃静置30min，离心；

6)洗涤：收集沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀，重复一次，挥干乙醇；

7)溶解：将所得沉淀加入50～100μL TE缓冲液溶解，保存备用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中：

步骤2)低速离心，离心速度是3000-4000r/min离心3-8min，

CTAB液为十六烷基三乙基溴化铵溶液，浓度是1.5-2.5％，

异丙醇的加入量是上清液体积的0.5-0.7倍；

步骤4)和步骤5)的离心速度为11000-13000r/min离心8-12min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中：

步骤2)第一次PCR扩增中：

所述PCR反应体系为25μL：

12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL，浓度为2.5μM/μL，DNA模板4μL浓度为40ng/μL，加纯水补足至25μL，

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环40次；72℃再延伸10min；4℃保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中：

步骤3)第二次PCR扩增中：

反应体系为25μL：

12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL，其中2.5μM/μL～5μM/μL，ITS通用引物对的PCR产物1μL～2μL作为本步骤的模板，加纯水补足至25μL，

具体的，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，循环32～35次；72℃再延伸5min；4℃保存。