[发明专利]不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法，包括以下步骤：构建针对不同种属待检球虫的TaqMan实时荧光定量PCR分析方法；采集临床测试球虫样品，并分离出球虫卵囊；进行抗球虫药物临床试验；通过分析药物试验前后样品球虫种群的组成及其所占比例的变化，获得不同种属待测球虫对药物的敏感性结果。本发明的快速检测方法，可以避免传统方法中需要数月才能完成的分离单个球虫的繁琐步骤，仅需几天时间，就能直接获得不同种属球虫的药物敏感性和抗药性试验结果，大大节省工作时间和人力物力，有利于临床球虫病的更好防控。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种不同种属球虫对不同抗球虫药物敏感性的快速检测方法及试剂盒。

背景技术

球虫病是由一种或多种球虫寄生于动物肠道等不同部位所引起的，以生长发育迟缓和肠黏膜等严重损伤为特征的寄生虫病。其中，鸡球虫病是由顶复门寄生虫中的艾美耳球虫(Eimeria)引起的一种或数种单细胞寄生原虫寄生于鸡肠道上皮细胞内所引起的疾病，是我国集约化养鸡场最常见的疾病，也是6-10％肉鸡死亡的主要原因，凡是养鸡的地方，就有鸡球虫的存在，每年全世界因鸡球虫造成的经济损失超过30亿美元，我国每年有该病所致的经济损失在50亿人民币以上。

鸡球虫为胞内专性寄生虫，其种类较多，目前大家所公认且最为常见的有7种鸡艾美耳球虫，分别是柔嫩(Eimeria tenella)、毒害(E.necatrix)、和缓(E.mitis)、布氏(E.brunetti)、堆型(E.acervulina)、巨型(E.maxima)和早熟艾美耳球虫(E.praecox)。不同种鸡艾美耳球虫在体内寄生部位、裂殖代数、卵囊形态、致病力和潜伏期等方面都不尽相同，通常E.tenella寄生于鸡盲肠中，E.acervulina和E.maxima主要寄生于十二指肠和小肠前段，E.necatrix寄生于小肠中断，E.mitis和E.praecox分别寄生于小肠前段和十二指肠及小肠前段。而就致病性来说，高致病性的有E.tenella和E.necatrix，中等致病性主要是E.acervulina和E.maxima，而E.brunetti、E.mitis和E.praecox的致病力相对较弱。鸡球虫病的防治主要依赖于饲料中的化学药物的添加，因此也导致了临床耐药虫株的普遍出现和兽药残留的危害风险，据报道，我国养禽业用于防治鸡球虫的费用约占总的禽病防治费用的三分之一。

兔球虫病由寄生于筋道和胆管上皮细胞的艾美耳属球虫引发,主要包括小型艾美耳球虫(E.exigua)、中型艾美耳球虫(E.media)、黄艾美耳球虫(E.flavescens)、大型艾美耳球虫(E.magna),盲肠艾美耳球虫(E.coecicola)、斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)等等，其中斯氏艾美耳球虫呈世界性流行,在我国的感染率和死亡率较高，造成了养兔业的的巨大经济损失。

抗球虫药物主要分为化学合成类和聚醚离子载体类，化学合成类主要有地克珠利Diclazuril、妥曲珠利Toltrazuril、二硝托胺、氯羟吡啶、癸氧喹酯、丁氧喹啉、尼卡巴嗪、氯苯胍、磺胺氯吡嗪、磺胺喹恶啉、氨丙啉、常山酮等。聚醚离子载体类主要有盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、马杜霉素、拉沙罗菌素等。不同的抗球虫药物对不同种属的球虫其本身具有不同的敏感性，如二硝托胺对柔嫩、毒害艾美耳球虫作用较强,对堆型艾美耳球虫的作用较弱，而氨丙林只对柔嫩艾美耳球虫有效等等，同时，球虫的抗药性产生也同样有种属的差异。

临床的球虫感染绝大部分是两种以上不同种属的混合感染，对临床样品进行的抗球虫药物有效性和敏感性试验，其结果通常只是针对混合感染而言，而不能了解对具体不同感染种属球虫的有效性和敏感性。当需要了解药物对具体某一特定球虫种属的抗药性和敏感性时，传统方法必须耗费大量人力物力首先进行球虫种属的分离和鉴定，继而采用分离后的虫种进行感染和相应的药物试验，以确定特定种属球虫的药物有效性和敏感性。该传统方法中，繁琐的球虫单卵囊分离技术，耗时耗力，至少需要数月时间才能完成分离鉴定工作，而且必须一个个虫种进行药物试验，工作量巨大。

发明内容