[发明专利]不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种不同种属球虫对药物敏感性的快速检测方法，包括以下步骤：

构建针对不同种属待检球虫的TaqMan实时荧光定量PCR分析方法；

采集临床测试球虫样品，并分离出球虫卵囊；

进行抗球虫药物临床试验，设感染用药组、感染不用药组和不感染不用药的健康对照组，感染试验组每个实验动物口服接种所述分离的待测样品的孢子化球虫卵囊，感染用药组饲喂添加抗球虫药的饲料，感染不用药组饲喂无药物添加饲料；

分别收集感染后的各组试验动物粪便，并分离收集卵囊和提取基因组，采用所述构建的方法进行相应的荧光定量PCR检测，通过分析药物试验前后，样品中球虫种群的组成及其所占比例的变化，获得不同种属待测球虫对药物的敏感性结果。

2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述构建TaqMan实时荧光定量PCR分析方法包括以下步骤：

针对不同种属球虫的特异基因设计荧光定量PCR引物对和TaqMan探针；

分别提取不同种属的纯种球虫的基因组，用所述引物对分别扩增出对应球虫的目的基因片段，将该目的基因片段连接到空载体中，形成标准重组质粒；

将分别含有不同种属球虫目的基因的标准重组质粒，用无核酸酶的水进行10倍倍比稀释，质粒的稀释浓度范围为1×10¹～1×10⁹质粒拷贝数，然后选出拷贝数是1×10²～1×10⁸的8个梯度作为模板进行荧光定量PCR反应；

反应结束，得到每个拷贝数对应的CT值，计算标准曲线。

3.根据权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于，所述引物对和探针包括下述任意一组或两组以上组合：

引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3；

引物对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探针SEQ ID NO:6；

引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探针SEQ ID NO:9；

引物对SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探针SEQ ID NO:12；

引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探针SEQ ID NO:15；

引物对SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探针SEQ ID NO:18；

引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探针SEQ ID NO:21。

4.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，所述感染试验组每个实验动物口服接种5～20万分离的待测样品孢子化球虫卵囊。

5.一种快速检测不同种属球虫对药物敏感性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：针对不同种属球虫的特异基因设计的荧光定量PCR引物对和TaqMan探针，该引物对和探针包含下述任意一组或两组以上组合：

引物对SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和探针SEQ ID NO:3；

引物对SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和探针SEQ ID NO:6；

引物对SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和探针SEQ ID NO:9；

引物对SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和探针SEQ ID NO:12；

引物对SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和探针SEQ ID NO:15；

引物对SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和探针SEQ ID NO:18；

引物对SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和探针SEQ ID NO:21。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：分别含有不同种属球虫目的基因的标准重组质粒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标准重组质粒的空载体为pEASY-T1载体。