[发明专利]一种草铵膦脱氢酶突变体及其在生产L-草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体及其在多酶偶联生产2‑氨基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑L‑丁酸铵中的应用，所述草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示氨基酸第375位进行单突变获得的。本发明制备的草铵膦脱氢酶突变体DyGDH‑V375S的比酶活较母本草铵膦脱氢酶提升了11‑12倍，最大底物2‑氨基‑4‑(羟基甲基氧膦基)‑D/L‑丁酸铵投料达到800mM，该草铵膦脱氢酶突变体更具工业应用前景。

技术领域

本发明涉及草铵膦脱氢酶DyGDH突变体的构建，开发草铵膦脱氢酶重组菌和酶在2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-L-丁酸铵(俗称L-草铵膦)手性生物合成方面的应用。

背景技术

草铵膦是世界上第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(现归属拜耳公司)开发生产，属磷酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

草铵膦活性介于草甘膦和百草枯之间，具有高活性、低毒易降解、环境友好等优势；另外，它还可以用于筛选抗草铵膦的转基因作物，因此它应用十分广泛，普遍受到市场青睐，未来也将具有广阔的市场前景。

草铵膦由一对具有旋光性的对应异构体混合而成，可以拆分为左旋体(顺式构型D)和右旋体(反式构型L)，其中只有L-草铵膦具有杀虫活性，且在土壤中易分解，对环境的破坏力小。

氨基酸脱氢酶超家族是一类NAD(P)H依赖型的氧化还原酶，其家族成员多是多亚基聚合体，单个亚基分子量从40KDa-120KDa不等，每个亚基都具有两个结构域(底物结合结构域和辅酶结合结构域)。氨基酸脱氢酶的底物谱一般比较严格，且催化产物大多是L-构型的，草铵膦脱氢酶即为氨基酸脱氢酶家族的一种，能够特异性催化草铵膦潜手性酮酸合成L-草铵膦。

我们从蒙氏假单胞菌Pseudomonas monteilii WP_060477601.1中克隆得到草铵膦脱氢酶基因，并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现该基因的异源过量表达，该酶能够与D-氨基酸氧化酶偶联利用“一锅法”催化D，L-草铵膦(2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵，D,L-PPT)转化为L-草铵膦，但该酶对其中间前手性酮酸产物2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸(PPO)的活力不够高，成为了“一锅法”过程中的限速步骤，从而限制了其工业化应用。本发明通过已报道的草铵膦脱氢酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的氨基酸位点，通过定点突变技术提高了草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸的催化活力，解除了限速环节，进而提高了L-草铵膦的产量，具有较强的工业应用价值。

发明内容

本发明目的是针对现有草铵膦脱氢酶对2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸不对称胺化还原活性不高的问题，提供一种草铵膦脱氢酶突变体及利用该草铵膦脱氢酶突变体基因重组菌及其粗酶液作为生物催化剂，用于L-草铵膦手性生物合成，该催化剂的活性提高了12倍，初始底物D,L-草铵膦浓度提高了8倍。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种草铵膦脱氢酶突变体，所述草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ IDNo.2所示氨基酸第375位进行单突变获得的。SEQ ID No.2所示氨基酸为母本草铵膦脱氢酶DyGDH₁，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。