[发明专利]一种草铵膦脱氢酶突变体及其在生产L-草铵膦中的应用

权利要求书

1.一种草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于所述草铵膦脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸第375位缬氨酸突变为丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸中的任一种。

2.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

3.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在不对称胺化还原2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸制备L-草铵膦中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的上清液为催化剂，以2-羰基-4-(羟基甲基氧膦基)-丁酸为底物，偶联辅酶再生系统，再加入助剂，以蒸馏水或缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-35℃、400-600rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述助剂为硫酸铵或甲酸铵；所述辅酶再生系统由辅酶再生酶基因工程菌湿菌体和辅酶再生底物构成，所述辅酶再生系统为下列之一：(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，构成包含NADPH和NADP⁺的葡萄糖脱氢酶再生系统；(2)以乙醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的乙醇脱氢酶辅酶再生系统；(3)以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物终浓度100-800mM，辅酶再生底物终浓度150mM-1.2M，助剂终浓度100mM-3.6M，催化剂和辅酶再生酶用量以破碎前湿菌体总重量计为10-100g/L。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶以葡萄糖脱氢酶基因与草铵膦脱氢酶突变体基因共表达基因工程菌形式加入；所述乙醇脱氢酶或甲酸脱氢酶分别以乙醇脱氢酶基因工程菌或甲酸脱氢酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的上清液的形式与催化剂混合；所述甲酸脱氢酶或乙醇脱氢酶基因工程菌湿菌体与草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体以质量比1:2混合。

7.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在手性拆分2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵制备L-草铵膦中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵为底物，以草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体偶联D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体或破碎上清液为催化剂，加入辅酶再生系统、过氧化氢酶和助剂，以蒸馏水或pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行拆分反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述助剂为硫酸铵或甲酸铵；所述辅酶再生系统由辅酶再生酶基因工程菌湿菌体和辅酶再生底物构成，所述辅酶再生系统为下列之一：(1)以葡萄糖为辅酶再生底物、以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶，构成包含NADPH和NADP⁺的葡萄糖脱氢酶再生系统；(2)以乙醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的乙醇脱氢酶辅酶再生系统；(3)以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物，构成包含NADPH和NADP⁺的甲酸脱氢酶辅酶再生系统；所述转化体系中，草铵膦脱氢酶突变体工程菌湿菌体、辅酶再生酶工程菌湿菌体和D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体总加入量为10-100g/L，底物终浓度100-800mM，辅酶再生底物终浓度150-1200mM，助剂终浓度为150-1200mM，过氧化氢酶终浓度为20-200U/L，其中葡萄糖脱氢酶以与草铵膦脱氢酶基因共表达形式加入，甲酸脱氢酶和乙醇脱氢酶以各自湿菌体与草铵膦脱氢酶湿菌体质量比2:1形式混合加入，所述D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体与草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体质量比为0.5-2:1。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：以2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)-D/L-丁酸铵为底物，以草铵膦脱氢酶突变体基因共表达葡萄糖脱氢酶基因工程菌湿菌体偶联D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体为催化剂，加入葡萄糖、过氧化氢酶和硫酸铵，以蒸馏水或pH7.4、100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在30-35℃、400-600转/分钟条件下进行拆分反应，反应结束，反应液分离纯化，获得L-草铵膦。