[发明专利]一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器

权利要求书

1.一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器，其特征在于，

包括以下原料：

1)8-17 DNAzyme；

2)苝-3，4，9，10-四甲酸分散的氮掺杂石墨烯NG-PTCA经硫堇Thi和金纳米粒子AuNPs修饰后组装发夹信号DNA H2所形成的信号检测探针NG-PTCA-Thi-Au-H2；

3)经5′-SH标记的具有茎环结构的捕获探针H1；

所述8-17 DNAzyme可捕获不同浓度的Pb²⁺以形成8-17 DNAzyme-Pb²⁺复合物，且其8-17DNAzyme在Pb²⁺存在下底物链S在切割位点被切割成两个片段，被切割的片段S1可与捕获探针H1的部分序列互补，并能基于碱基互补配对进行杂交，以打开茎环结构的捕获探针H1，并打开H2以形成H1-S1-H2复合物杂交，并在H1-S1-H2复合物杂交过程中释放S1以启动下一个循环并实现信号放大。

2.根据权利要求1所述的基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器，其特征在于，所述NG-PTCA-Thi-Au-H2复合物的制备方法如下：

(1)PTCA纳米材料的制备：

首先将500mg PTCDA溶在50ml 1M NaOH水溶液中，然后在80℃下水解PTCDA 1小时，当黄绿色溶液中出现红色沉淀时，将1M盐酸缓慢滴加到上述混合物中并最终保持pH为弱酸性，随后，通过12000rpm离心收集红色沉淀并利用冷冻干燥器干燥收集，得到产物PTCA；

(2)NG-PTCA纳米复合材料的制备：

首先将10mg NG与2mg PTCA溶在10mL超纯水中并超声2小时后，将溶液在环境温度下连续搅拌5小时并过夜，最后，将混合物离心并用超纯水洗涤三次，在60℃下真空干燥后收集，得到产物NG-PTCA；

(3)NG-PTCA-Thi-Au纳米复合物的制备：

将NG-PTCA溶液超声40分钟，然后将0.5mM的Thi和1％的HAuCl4溶液按Thi/HAuCl4＝5∶2的摩尔比加入到1mg/mL的NG-PTCA溶液中，在室温和黑暗条件下剧烈搅拌12小时，然后通过9000rpm离心15分钟收集所得纳米复合材料再用超纯水洗涤三次，最后，将沉淀溶解在2mL水中，并将其保存在4℃环境下备用；

(4)NG-PTCA-Thi-Au-H2复合物的制备：

发夹信号DNA H2在95℃水浴中加热5分钟，逐渐冷却至室温以形成茎环结构，将1mLNG-PTCA-Thi-Au纳米复合物分散和在200μL的5′-SH标记的H2混合在一起，同时温和搅拌12小时，通过Au-S共价键将H2充分固定在纳米复合材料的表面上，然后离心并用超纯水清洗获得信号检测探针NG-PTCA-Thi-Au-H2，最后，将信号检测探针分散在pH 7.4的1.0mL PBS中并保存在4℃冰箱备用。

3.根据权利要求1或2所述的一种基于双信号放大的用于重金属铅离子检测的生物传感器的使用方法，其特征在于：

1)8-17 DNAzyme的制备与切割

首先将2μM底物链在95℃水浴中加热5分钟，然后缓慢冷却至室温，接下来，将相同体积的2μM催化链与底物链混合并在65℃水浴中孵育10分钟，使水浴缓慢冷却至室温以确保其杂交形成1μM的8-17 DNAzyme；将不同浓度的Pb²⁺加入到5μL 8-17 DNAzyme中，并在37℃培养箱中反应40分钟，8-17 DNAzyme的催化中心可以捕获Pb²⁺，并与8-17 DNAzyme碱基配位形成8-17 DNAzyme-Pb²⁺复合物结构，然后，在Pb²⁺存在下，8-17 DNAzyme在rA切割位点有效地催化了切割反应，将底物链S切割成两个片段，被切割的片段S1与H1的部分序列互补，并能基于碱基互补配对进行杂交；

2)所述信号检测探针NG-PTCA-Thi-Au-H2的制备；

3)建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线。

4.根据权利要求3所述的使用方法，其特征在于：

所述建立电化学生物传感器，测定重金属铅离子，绘制标准曲线，包括如下步骤：

(1)在构建传感器之前，将2μM 5′-SH标记的捕获探针H1在95℃下加热5分钟，然后，将溶液缓慢冷却至室温以形成茎环结构；

(2)分别用0.3和0.05μm的Al2O3粉末将电极抛光成镜面，然后分别按超纯水、无水乙醇、超纯水的顺序超声电极各5min，室温干燥备用；

(3)干燥后的电极在-0.2V的恒电压下用1％HAuCl4溶液沉积30s，最终形成均匀的AuNPs层，并用超纯水清洗；

(4)清洗并干燥后的电极用0.5mM MCH封闭30分钟并用超纯水冲洗干净；

(5)干燥后，在电极表面滴加10μL 2μM发夹结构的捕获探针H1，并在37℃下孵育1个小时；

(6)超纯水冲洗并干燥后，将制备好的电极滴加10μL不同浓度Pb²⁺切割的DNAzyme片段S1，并在37℃下孵育2个小时；

(7)将上步修饰的电极用超纯水冲洗并干燥后，在其表面滴加10μL NG-PTCA-Thi-AuNPs-H2，并在37℃孵育2个小时，用超纯水清洗并干燥；

(8)制备的生物传感器在5mL，0.1M，pH 7.4的PBS中在室温下用方波伏安法检测Thi产生的电流响应信号；

(9)根据所得电流变化值与重金属铅离子浓度呈线性关系，绘制工作曲线。