[发明专利]多重连接探针微阵列检测

说明书

本发明提供了多重连接探针微阵列检测。具体地，本发明的基于表面探针的定量PCR检测体系包括：(a)一固相载体；(b)第一探针；(c)第二探针；(d)用于连接所述第一探针和第二探针，形成第三探针的连接酶；(e)用于扩增所述第三探针的淬灭引物对；(f)与淬灭扩增产物相匹配的固定于固相载体上的淬灭产物捕获核酸。本发明还提供了相应的检测方法、检测装置和应用。本发明可快速、简便、高效、同时对多种靶序列进行定量检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地涉及多重连接探针微阵列检测。

背景技术

在医学、食品、卫生等各种不同领域，常常需要对待测样品进行核酸检测。目前，常用的检测方法包括常规PCR、定量PCR、探针检测、芯片检测、测序等多种技术。

在常规的荧光定量PCR(qPCR)中，在检测体系中存在用于扩增的引物对以及用于检测的探针。其中，在溶液里的探针一侧(或一端)有荧光剂(fluorophore)，另一侧(或另一端)有淬灭剂(quencher)。该探针完好的时候，因为淬灭剂和荧光剂距离足够近，淬灭剂就能有效抑制荧光剂，从而没有(或基本没有)荧光信号。当溶液里存在与该探针序列匹配的核酸样本时，那么在样本被PCR扩增的过程中，该探针被扩增酶剪切，于是荧光剂和淬灭剂会互相脱离开来，导致抑制作用减少或消失，从而使得荧光剂产生荧光信号。

然而，目前的荧光定量PCR还存在一些缺点，其中包括：探针因为同时标记荧光剂和淬灭剂，探针合成成本偏高；为了使溶液中的探针被扩增酶剪切，扩增酶需具有5’→3’的核酸外切酶活性，然而某些扩增酶不具有5’→3’的核酸外切酶活性因此不适用于qPCR。更重要的是，因为每一个待测序列需要一种发光光谱可与其它荧光剂区别开来的荧光剂，所以同一个qPCR反应中能同时进行检测的不同种核酸数量受到很大的限制，通常一个qPCR反应只能做到4-5重多重检测。此外，即使能够实现多重qPCR，因为需要同时读取多个不同荧光剂，其对应的光学检测设备设计复杂，造价昂贵。

因此，本领域迫切需要开发一种只用一对引物和多对探针，进行多重连接依赖式扩增以达到针对特定序列的定量检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种只用一对引物和多对探针，进行多重连接依赖式扩增以达到针对特定序列的定量检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种基于表面探针的定量PCR检测体系，所述检测体系包括：

(a)一固相载体，所述固相载体的一个主表面设有n个子检测区，其中，n为≥2的正整数，并且至少一个子检测区为表面定量子检测区；

其中，所述的各表面定量子检测区各自独立地固定有淬灭产物捕获核酸，所述淬灭产物捕获核酸为单链核酸，并且所述淬灭产物捕获核酸的一端固定于所述的固相载体的表面，并且所述淬灭产物捕获核酸带有第一可检测标记物，所述的第一可检测标记物选自下组：荧光基团、发光标记物、量子点、或其组合；

(b)第一探针；

(c)第二探针；

(d)用于连接所述第一探针和第二探针，形成第三探针的连接酶；

(e)用于扩增所述第三探针的引物对，其中所述引物对包括第一引物和第二引物，其中第一引物和第二引物中至少一个引物为淬灭引物，所述淬灭引物的一端或一侧连接有淬灭基团，

并且，所述淬灭引物通过扩增生成的淬灭扩增产物与至少一个表面定量子检测区的淬灭产物捕获核酸是可结合从而形成双链结构，并且在所述双链结构中，所述的淬灭扩增产物的淬灭基团使得所述捕获核酸的第一可检测标记物(如荧光基团)的信号被淬灭。

在另一优选例中，所述第一探针具有式II结构：

X₂’-T₂’ (II)