[发明专利]一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法

说明书

本发明提供了一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法，其是以提取的CyHV‑2 cDNA为模板，扩增出ORF66基因，将扩增的ORF66基因连接至杆状病毒载体pFastBacHTA中，构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA‑CyHV‑ORF66，转化至大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，获得重组穿梭杆粒rBacmid‑CyHV‑ORF66，鉴定正确后将其转染至Sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并将重组杆状病毒进行传代扩增，将高滴度的含有CyHV‑2‑ORF66基因的杆状病毒接种到sf9昆虫细胞中进行CyHV‑2‑ORF66蛋白的真核表达。选用本发明方法构建鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体，并利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白，为制备鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白特异性单抗提供了材料，为鲤疱疹病毒血清学ELISA检测方法的建立奠定了基础。

技术领域

本发明涉及生物技术中基因重组表达领域，特别涉及一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法。

背景技术

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)是造成鲫造血器官坏死病的病原，该病毒隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、鱼疱疹病毒科(Alloherpesviridae)、鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)，CyHV-2与分离自鲤科鱼类的另外两种病毒鲤疱疹毒1(Cyprinid herpesvirus 1,CyHV-1)和鲤疱疹病毒3(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)亲缘关系较近,与沟鲇疱疹病毒(Ictalurid herpes-virus 1,IcHV-1)关系相对较远。在病原学方面，CyHV-2具有鱼类疱疹病毒的一般特征。病毒呈球形，具有二十面体立体对称的衣壳结构，内部包有长度约为290,304bp的双股DNA，外面为皮质层和囊膜。现已确认，鱼类疱疹病毒基因组含有12个核心ORF，这些编码蛋白在CyHV-1和CyHV-3中均有分布，主要参与病毒复制、装配以及衣壳的形成等过程。Jung等在1995年对CyHV-2进行了第一次报道,发现CyHV-2是金鱼造血器官坏死病的致病病原。之后在美国、澳大利亚、中国台湾、英国养殖的金鱼也暴发该病。自从2011年匈牙利首次在养殖的鲫鱼体内检测到CyHV-2后，近几年来关于CyHV-2感染鲫鱼的报道也逐渐增多,该病毒在中国、日本、美国、澳大利亚、英国、新西兰等地广泛传播，造成养殖鲫鱼和金鱼大量死亡。这些报道均表明CyHV-2是一种新生养殖鲫鱼病毒病，其发病区域在逐年扩大。CyHV-2病害已经引起我国水产养殖业管理部门及养殖户高度重视。目前还没有能防治的疫苗，必须建立一种快速而又能准确检测诊断本病的方法。

近几年，国内外学者陆续也报道一些CyHV-2的检测方法。Goodwin(2006)等针对CyHV-2聚合酶基因建立了PCR技术，从患病金鱼的病变组织的均扩增出病毒的核酸片段；随后，他们又建立了基于聚合酶基因的实时定量PCR法，最低检测限为1个病毒基因拷贝；Waltzek等(2005)根据病毒解旋酶基因，建立了PCR检测方法，该方法对CyHV-1，CyHV-3的样品均无扩增。He等(2013)根据末端酶基因序列，建立了检测CyHV-2的LAMP检测方法，该方法具有较高的灵敏度，可在10min内完成检测。虽然分子生物学检测技术具有较高的灵敏性，但也易因模板污染而引起假阳性现象，因此，不能将其作为诊断CyHV-2感染的唯一标准。另一方面，由于分子生物学等技术需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。鉴于免疫学检测方法快速、简便的特点，亟需开发一种快速简便的检测技术，以满足该病的现场快速诊断的需要。胶体金诊断试纸条是一种采用双抗夹心ELISA模式开发的新型免疫学检测工具，具有简便快速、肉眼判断、放大反应等优点，一般只要5-10分钟就可快速检测，能极大满足基层现场检测病毒的要求。胶体金诊断试纸条的核心部件是针对病原的特异性单克隆抗体，要想获得特异性单抗必须有高纯度高活性的特异性抗原。