[发明专利]一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法在审
| 申请号： | 201910699686.0 | 申请日： | 2019-07-31 |
| 公开（公告）号： | CN110408655A | 公开（公告）日： | 2019-11-05 |
| 发明（设计）人： | 李强;栾林林 | 申请（专利权）人： | 盐城工学院 |
| 主分类号： | C12N15/866 | 分类号： | C12N15/866;C12N15/66;C12N15/38 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 吴爽 |
| 地址： | 224051 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 疱疹病毒Ⅱ型 杆状病毒表达载体 蛋白重组 扩增 制备 重组杆状病毒 蛋白 构建 大肠杆菌感受态细胞 重组杆状病毒表达 重组杆状病毒载体 传代 杆状病毒载体 杆状病毒 基因连接 昆虫细胞 真核表达 疱疹病毒 高滴度 血清学 基因 单抗 杆粒 转染 接种 转化 | ||
1.一种鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体，其特征在于，该重组杆状病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体，其特征在于，所述鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体特征包括重组修饰的昆虫杆状病毒，所述昆虫杆状病毒表面展示有鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白。
3.根据权利要求1-2任一项所述的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体，其特征在于，所述鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
4.权利要求3所述的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，其特征在于，具体制备步骤包括：
(1)构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF66和重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF66；
(2)在昆虫细胞中表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白。
5.根据权利要求4所述的鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白重组杆状病毒表达载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，构建重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF66和重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF66的步骤为：
a、构建重组杆状病毒表达鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF66蛋白的特异性引物，所述特异性引物见表1：
表1 所需引物及酶切位点
引物名称 引物序列 CyHV-ORF66-Fwd GGATCCATGACATCCCTCCAGCA-3’]]> CyHV-ORF66-Rev AAGCTTTTAATAAATCATCAGGTCGTCT-3’]]> pFastBac-F 5’-TATTCCGGATTATTCATACC-3’ pFastBac-R 5’-ACAAATGTGGTATGGCTGA-3’
CyHV-ORF66-Fwd的酶切位点为
CyHV-ORF66-Rev的酶切位点为
b、采用PCR技术，提取异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型脾脏RNA，并反转录出cDNA；以cDNA为模板扩增ORF66基因序列，将扩增的PCR产物进行胶回收经BamH I和Hind III双酶切后，通过DNA连接酶插入到经同样双酶切的pFastBac HTA表达载体中，转化至E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养，挑取菌落于氨苄抗性的培养基中培养，提取质粒，进行BamH I和HindIII双酶切鉴定，筛选出阳性克隆，测序鉴定正确，获得重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF66；
c、将重组杆状病毒载体pFastBac HTA-CyHV-ORF66转化至含有穿梭载体Bacmid的E.coliDH10Bac中，构建重组穿梭杆粒rBacmid-CyHV-ORF66。
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