[发明专利]一种乙型肝炎病毒分型和耐药基因检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种乙型肝炎病毒分型和耐药基因检测试剂盒，具体地本发明公开了一种利用多重不对称PCR技术及电化学基因传感器法检测乙型肝炎病毒型别和耐药位点相关的检测试剂盒及其检测方法，实验结果表明，本发明的检测方法和试剂盒检测准确性好、特异性高、操作简单自动化、通量较高的优势，能够为乙型肝炎患者用药提供了重要参考。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种乙型肝炎病毒分型和耐药基因检测试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒，可引起人类肝脏病变，是造成肝硬化、肝癌及慢性肝炎发生的主要原因。它是一个严重的全球卫生问题。据WHO估计，全球有2.5亿乙肝病毒感染者(乙肝表面抗原阳性)，2015年乙型肝炎导致88.7万人死亡。

中国是乙肝大国，患者占全球患者的四分之一。HBV已发现有9个基因型(A～I)，其分布具有地域性。在我国中东部地区以B、C基因型占优势；南方大部分地区流行株为B2、C2、C1亚型，并有少部分D基因型；西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主。研究发现，HBV亚型的类别与HBV的致病性、临床表现及抗病毒药物治疗的选择都有一定的相关性。因此，对HBV感染者的血清或血浆先进行分型分析，能为临床治疗起到重要的指导作用。而与此同时，一个更加严峻的问题正危及着中国广大的乙肝患者，当前中国已有约35％以上的患者产生乙肝核苷类药物的耐药，乙肝病毒耐药已成为当今乙肝治疗领域最大的挑战。

目前，临床使用治疗乙型肝炎病毒的核苷(酸)类似物药物主要为拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LdT)，通过这些药物抑制病毒的复制，减少病毒载量。这些药物都无法完全治愈乙肝病毒，患者需要长期服药来维持治疗。由于患者长期使用抗HBV治疗药物，HBV病毒会发生不同程度的耐药突变。在乙肝治疗中，耐药情况一旦发生，原本有效的抗病毒药物的抑制病毒复制能力就会大大降低。同时，耐药会导致病情反复、疾病进展等不良后果，而药物之间的交叉耐药也会给后续治疗的选择带来极大的困难。乙肝病毒耐药的检查主要是检查机体的乙肝病毒是否产生变异以及耐药，通过乙肝病毒耐药变异的检查，我们可以了解到乙肝病毒的数量，复制情况，传染性的强弱以及适合服用哪一类的药物比较有效等。从而为乙肝的治疗康复打下坚实的基础。因此临床上检测乙肝病毒耐药突变位点对及时调整治疗方案、指导临床用药及实时监控抗病毒药物疗效具重要的指导意义。

目前常用的分型和SNP突变位点检测方法有实时荧光PCR法、PCR-Sanger测序法、芯片法、PCR-高分辨率溶解曲线(HRM)法等。

实时荧光PCR法灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。但该方法通量不高，探针成本较高，单个位点的检测成本与样本量有关，样本量越小，成本越高。

PCR-Sanger测序法属于定性检测，优点是测序长度较长，可发现新的变异位点。主要不足：灵敏度不高，尤其是在进行肿瘤组织体细胞突变检测时，当组织中靶标基因突变比例低于20％时，可能出现假阴性结果；对试剂和仪器有特殊要求，不易普及；操作复杂，成本相对较高，速度慢、通量低。

芯片法主要是反向斑点杂交技术，该方法使用的仪器简单，但杂交过程耗时较长，操作复杂，灵敏度低；

PCR-高分辨率熔解曲线(HRM)法操作简便、快速、通量大、使用成本低、结果准确，有利于实现闭管操作，在进行甲基化检测时可根据熔解曲线确定甲基化程度的高低。该方法的缺点是：不能排除待测核酸中新出现的遗传变异；由于单个碱基突变导致DNA解链温度的变化非常小，该方法对仪器的灵敏度和分辨率有较高要求。

因此，本领域技术人员致力于开发准确度高、操作简单，可同时检测多种基因型别和耐药位点的新的分子诊断方法，以指导临床用药。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒分型和耐药基因检测试剂盒。