[发明专利]一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，所述的试剂盒由样品垫（1）、结合垫（3）、反应垫（2）、吸水垫（4）和PVC底板（5）组成，所述样品垫（1）、结合垫（3）、反应垫（2）和吸水垫（4）依次搭接在PVC底板（5）上，其特征在于：

所述的反应垫（2）上设置有包被有抗CA125抗体的检测线T1、包被有抗HE4抗体的检测线T2、包被有羊抗鼠IgG的质控线C；

所述的样品垫（1）经样品垫处理液处理，样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、蔗糖、中性盐、牛血清白蛋白和吐温组成；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01 mol/L，pH为7.2，中性盐为氯化钠，浓度为300 mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10%，Tween-20的体积终浓度为0.05%，蔗糖的质量浓度为7%，磷酸盐缓冲液中Na₂HPO₄·12H₂O的质量含量为0.26%，NaH₂PO₄·2H₂O的质量含量为0.044%。

2.如权利要求1所述的纳米硒试剂盒，其特征在于所述的纳米硒与抗HE4抗体和抗CA125抗体偶联的复合物经工作液悬浮固化于结合垫（3）上，所述工作液由磷酸盐缓冲液、中性盐、牛血清白蛋白、糖类和吐温组成，所述中性盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化钡、硫酸钙、硝酸钾中的一种；所述糖类选自单醣、双醣或多糖中的一种。

3.如权利要求2所述的纳米硒试剂盒，其特征在于，所述工作液中的糖类为蔗糖和海藻糖，所述的工作液的磷酸盐缓冲液的浓度为0.01 mol/L，pH为7.2。

4.如权利要求3所述的一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒，其特征在于，所述中性盐浓度为150-500mM。

5.一种快速检测HE4和CA125的纳米硒试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）纳米硒的制备

取超纯水，加入PEG，搅拌，得PEG溶液；将SDS溶于PEG溶液中，搅拌，得模板溶液；将亚硒酸溶于模板溶液中，搅拌，得亚硒酸溶液；将维生素C溶于亚硒酸模板溶液中，搅拌，即得纳米硒；

（2）抗体标记

取1mL步骤（1）制备得到的纳米硒，加入10 μL浓度为1 mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为7.5；再加入2 μL的2 mg/mL的Anti-HE4-Ab1，室温混合30 min，使Anti-HE4-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-HE4-Ab1的标记；

取1 mL步骤（1）制备得到的纳米硒，加入12 μL浓度为1 mol/L的碳酸钾溶液，调节体系的pH值为8.0；再加入3 μL的2 mg/mL的Anti-CA125-Ab1，室温混合30 min，使Anti-CA125-Ab1充分的结合到纳米硒粒子上，完成Anti-CA125-Ab1的标记；

（3）封闭

向步骤（2）中纳米硒标记的Anti-CA125-Ab1和纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1中加入牛血清白蛋白溶液，控制牛血清白蛋白的质量终浓度为1%，室温混匀30 min；

（4）重悬

封闭后的纳米硒标记抗体在10000 rpm下离心10 min，弃去上清，沉淀用120 μL的工作液重悬；

所述工作液由磷酸盐缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖和Tween-20组成，其中磷酸盐缓冲液浓度为0.01 mol/L，pH 为7.2；氯化钠浓度为150 mM，牛血清白蛋白质量终浓度为2%，蔗糖质量终浓度为3%，海藻糖质量终浓度为3%，Tween-20体积终浓度为0.1%；磷酸盐缓冲液中，Na₂HPO₄·12H₂O质量含量为0.26%，NaH₂PO₄·2H₂O质量含量为0.044%；

（5）样品垫的制备

把GF-08玻璃纤维膜裁剪成220 mm×100 mm，浸泡在样品垫处理液中5 min，然后在40℃的鼓风干燥箱中干燥12 h，取出即得样品垫，放入自封袋中备用；

样品垫处理液由磷酸盐缓冲液、氯化钠、牛血清白蛋白、蔗糖和Tween-20组成，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.01 mol/L，pH为7.2，氯化钠浓度为300 mM，牛血清白蛋白的体积终浓度为10%，Tween-20的体积终浓度为0.05%，蔗糖的质量浓度为7%，磷酸盐缓冲液中Na₂HPO₄·12H₂O的质量含量为0.26%，NaH₂PO₄·2H₂O的质量含量为0.044%；

（6）结合垫的制备

将步骤（2）纳米硒标记的Anti-HE4-Ab1和Anti-CA125-Ab1分别均匀的铺在GF-06玻璃纤维膜上，干燥，使标记抗体的纳米硒粒子固化在玻璃纤维膜上即得结合垫，取出放入自封袋，加入干燥剂，密封保存；

（7）反应垫的制备

将硝酸纤维素膜贴在PVC板上，然后用0.01 mol/L，pH7.2的PBS把Anti-CA125-Ab2稀释至浓度为 2 mg/mL，作为T1检测线包被原；把Anti-HE4-Ab2稀释至浓度为 1 mg/mL，作为T2检测线包被原；把羊抗鼠IgG稀释为2 mg/mL，作为质控线C包被原；用喷金划膜仪以1 μL/cm划膜，置于40℃鼓风干燥3 h即得反应垫，取出放入自封袋，备用；

（8）试剂盒组装

将结合垫贴在反应垫的前端，再将样品垫贴在结合垫的前端，最后将吸水纸的前端贴在反应垫的后端，另一端贴在PVC板的末端，即完成试纸条的组装，可得HE4联合CA125快速检测试剂盒。