[发明专利]一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物

说明书

本发明公开了一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物，包括如下步骤：寻找常用工业生产质粒骨架的高度同源序列，以这些高度同源序列为靶标设计qPCR引物；排除在大肠杆菌与人基因组中可能发生非特异扩增的引物，选择扩增片段较小的qPCR引物，并保证扩增片段为同源性最高的区域；进行SYBR‑Green qPCR实验验证引物，将含该扩增片段质粒的梯度稀释作为标准品，计算引物的扩增效率，线性相关系数，热融解曲线；在转化有含该扩增片段质粒的大肠杆菌样品中进行质粒拷贝数检测。本发明的qPCR引物针对工业生产质粒高度同源区域设计，扩增效率高、定量线性好、特异性好。由于扩增片段仅50bp，可将其用于以质粒DNA为原料生产的产品（如病毒）中质粒DNA残留定量。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种qPCR方法，尤其涉及一种通用qPCR质粒定量方法及通用引物。本发明可通用于绝大部分工业发酵生产质粒DNA的qPCR定量，也可用于以这些质粒DNA为原料生产的产品（如病毒）中质粒DNA残留定量。

背景技术

质粒DNA是细胞免疫疗法、基因疗法等新兴生物制药领域的重要原材料或产品成分。质粒DNA的工业生产使用大肠杆菌发酵然后纯化得到高纯度的质粒DNA，为了优化生产工艺以及对生产用大肠杆菌菌种进行质量检测，需要检测大肠杆菌中质粒拷贝数；对于以这些质粒DNA为原料生产的产品（如病毒），也需要对其进行质粒DNA残留的检测（qPCRDNA残留检测要求扩增片段尽可能小）。常规qPCR定量方法需要针对不同的质粒分别设计特异引物/探针并验证其特异性与扩增效率。

本领域亟需研发一种可通用于绝大部分工业发酵生产质粒DNA的qPCR质粒定量方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种通用qPCR质粒定量方法，该方法可作为一种通用的质粒DNA定量方法，且由于扩增片段仅50bp，也可将其用于以质粒DNA为原料生产的产品（如病毒）中质粒DNA残留定量。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于qPCR质粒定量的通用引物。

为解决上述技术问题，本发明设计思路如下：为了提高产量，目前几乎所有工业生产的质粒DNA均携带高拷贝复制起始位点（ORI），使用中、高拷贝的pUC、pMB、pBR322等骨架设计构建而成，而这些中、高拷贝质粒骨架的ORI均可追溯至天然质粒pColE1，具有高度同源性，本发明针对这些质粒的高度同源序列设计qPCR引物（扩增片段长度仅50bp），并验证其在大肠杆菌中可特异扩增。

本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供了一种通用qPCR质粒定量方法，包括如下步骤：

步骤1，寻找常用工业生产质粒骨架的高度同源序列，以这些高度同源序列为靶标设计qPCR引物；

步骤2，设计引物时排除在大肠杆菌与人基因组中可能发生非特异扩增的引物，选择扩增片段较小的qPCR引物，并保证扩增片段为同源性最高的区域，即序列完全一致区域；

步骤3，进行SYBR-Green qPCR实验验证引物，将含该扩增片段质粒的梯度稀释作为标准品，计算引物的扩增效率，线性相关系数，热融解曲线；在转化有含该扩增片段质粒的大肠杆菌样品中进行质粒拷贝数检测，根据热融解曲线验证其在大肠杆菌基因组存在时的特异性。

作为本发明优选的技术方案，步骤1中，所述常用工业生产质粒骨架包括常用中、高拷贝质粒骨架pBR322、pUC系列，常用原核表达载体pET系列、pGEX系列，常用克隆载体pGEM系列，常用噬菌体展示载体pBlueScript系列；选用以上系列质粒中的一种作为代表进行多序列比对。

作为本发明优选的技术方案，步骤2中，设计的引物序列与扩增片段序列如下：

pORI-F：5’-CTCGTGCGCTCTCCTGTTC-3’，如SEQ ID NO:1所示；