[发明专利]一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法，该CPA引物是针对两个靶点femA及mecA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a，引物序列如前文SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.10所示；其检测方法是建立检测femA和mecA的交叉引物恒温扩增反应体系，进行交叉引物恒温扩增反应，观察两个反应体系颜色变化，若两个反应体系颜色都变为绿色，说明待检测样品中含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；否则说明检测样品中不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本发明的引物和方法检测时间快，可以在60分钟左右获得检测结果；此外，检测灵敏度高，达到fg/μL的级别。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法。

背景技术

目前微生物的检测鉴定方法主要分为培养鉴定法、免疫检测法及核酸检测。培养鉴定法及免疫检测法操作繁琐、实验周期长，对实验人员专业水平要求高。

交叉引物恒温扩增(Crossing Priming Amplification,CPA)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。但该反应引物设计难度较高，需要在有限的产物长度中设计五条引物，且避免五条引物自身发生非特异性扩增而影响结果，因此引物的设计尤为重要。

金黄色葡萄球菌(金葡菌)在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及动物和人的排泄物中都存在。这样的情况导致了其对食品的污染机会很高。金葡菌是一种常见的条件致病性食源性微生物，为侵袭性细菌，其分泌的葡萄球肠毒素可导致人类发生食物中毒。其产生的毒素对肠道破坏性大，引起的肠炎疾病起病急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热和腹泻。由金葡菌感染所导致的中毒食品种类很多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。同时治疗过程中抗生素的使用也导致了大量耐甲氧西林金葡菌在食源性食品中被发现，给人类健康和临床治疗带来了巨大的挑战。目前由耐甲氧西林金葡菌引起的食品安全事故已经成为世界性的卫生问题。

中国专利申请CN 109355403A公开了一种PSR检测耐甲氧西林金葡菌的引物、试剂盒与方法。然而该专利的检测限仅达到pg/μL级别，灵敏度不够高，限制了适用范围。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的CPA引物。

本发明的另一目的在于提供一种含有上述CPA引物的耐甲氧西林金葡菌检测试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种耐甲氧西林金葡菌的CPA检测方法，该方法具有灵敏度高(检测限达到fg/μL级别)、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场检测应用等特点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的CPA引物，是针对两个靶点femA及mecA设计的，包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下所示：

靶点femA剥离引物4s：5’-tcaaatcgcggtccagtg-3’(SEQ ID NO.1)

靶点femA剥离引物5a：5’-aaccaatcattaccagca-3’(SEQ ID NO.2)

靶点femA交叉引物2a1s：5’-tacctgtaatctcgccataacatcgttgtctatacct-3’(SEQID NO.3)

靶点femA特异引物2a：5’-tacctgtaatctcgccat-3’(SEQ ID NO.4)

靶点femA特异引物3a：5’-ggtaaatatggatcgatatg-3’(SEQ ID NO.5)