[发明专利]一种检测耐甲氧西林金葡菌的CPA引物及试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一组检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的CPA引物，其特征在于包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列如下所示：

靶点femA剥离引物4s：5’- tcaaatcgcggtccagtg -3’(SEQ ID NO.1)

靶点femA剥离引物5a：5’- aaccaatcattaccagca -3’(SEQ ID NO.2)

靶点femA交叉引物2a1s：5’- tacctgtaatctcgccataacatcgttgtctatacct -3’ (SEQID NO.3)

靶点femA特异引物2a：5’- tacctgtaatctcgccat -3’(SEQ ID NO.4)

靶点femA特异引物3a：5’- ggtaaatatggatcgatatg -3’ (SEQ ID NO.5)

靶点mecA剥离引物4s：5’- gcgataatggtgaagtag -3’(SEQ ID NO.6)

靶点mecA剥离引物5a：5’- gatcaatgttaccgtagtt -3’(SEQ ID NO.7)

靶点mecA交叉引物2a1s：5’- ttacgatcctgaatgtttatgactgaacgtccgata -3’ (SEQ IDNO.8)

靶点mecA特异引物2a：5’- ttacgatcctgaatgttt -3’(SEQ ID NO.9)

靶点mecA特异引物3a：5’- tctttaacgcctaaacta -3’ (SEQ ID NO.10)。

2.一种检测耐甲氧西林金葡菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的CPA引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：各CPA引物的浓度为10 μM。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括如下组分：

A、2×反应缓冲液：40.0 mM的Tris-HCl，20.0mM的硫酸铵，20.0mM的氯化钾，16.0mM的硫酸镁，0.2%（v/v）的Tween 20，1.4 M的甜菜碱，10.0 mM的 dNTPs；

B、Bst DNA 聚合酶；

C、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的组分B是浓度为8U/μL的Bst DNA聚合酶水溶液。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的组分C中，钙黄绿素与氯化锰的浓度比为1:8。

7.一种根据权利要求2所述的试剂盒检测耐甲氧西林金葡菌的方法，所述的方法为非疾病诊断的实验研究方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取待检样品的DNA作为模板DNA，并控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8～2.0；

（2）分别建立检测femA和mecA的交叉引物恒温扩增反应体系，于63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于高于80℃的水浴中保温至少2分钟终止反应；

其中，所述的交叉引物恒温扩增反应体系为：2×反应缓冲液12.5 μL，10μM的剥离引物4s和10μM的剥离引物5a各1.5μL，10 μM的交叉引物2a1s 2.5μL，10μM的特异引物2a和10μM的特异引物3a各1.25μL，DNA模板1.0 μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶1.0 μL，加去核酸水补足至25 μL；最后加入1 μL的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；

（3）观察两个反应体系颜色变化，若两个反应体系颜色都变为绿色，说明待检测样品中含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；否则说明检测样品中不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。