[发明专利]一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法

说明书

本发明公开了一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法。该方法包括以下步骤：1)采集监测区域的海水样本；2)提取海水样本中的总DNA；3)利用特异性引物对总DNA进行qPCR扩增；4)根据扩增结果进行监测结果判定。所述特异性引物的序列为：正向引物，5'‑CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC‑3'；反向引物，5'‑GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT‑3'。该方法可以快速准确的鉴定调查海域是否有中华白海豚的存在，克服了常规监测方法容易受到地形、天气、能见度和观测者经验的影响的缺陷。

技术领域

本发明涉及一种基于环境DNA技术的生物检测方法，具体涉及一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法。

背景技术

种群分布监测是评估某物种生存状况的重要手段，是对其时空分布变化、种群趋势变化、核心栖息地变化做出重要判断的依据，也是实施种群管理和保育措施的基础。目前，中华白海豚的种群监测方法主要是目视观测法和声纳观测法。这两种方法的工作量大，调查成本高，同时会受到地形、天气、能见度和观测者经验等的影响，难以提供充分和全面的证据，为濒危物种的调查研究与保护进展推进增加了挑战。因此，亟待寻找一种高效、便捷、成本低廉和受限小的技术，以方便中华白海豚种群分布的检测工作并推进白海豚保育工作的快速进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种干扰因素少、准确可靠的监测中华白海豚种群分布的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种基于海水样本监测中华白海豚种群分布的方法。该方法包括以下步骤：

1）采集监测区域的海水样本；

2）提取海水样本中的总DNA；

3）利用特异性引物对总DNA 进行qPCR扩增；

4）根据扩增结果进行监测结果判定。

利用环境DNA（eDNA）测量生物多样性是近年兴起的新技术。该技术常用于淡水领域的物种检测，主要针对淡水环境中某一类群体的多样性检测。相比于淡水环境，海洋环境的盐离子浓度高而且伴随着潮汐洋流而形成更大的稀释度。其次，中华白海豚作为珍稀濒危物种，其种群密度低，释放到海洋中基因识别片段过少，容易导致采集水样过程中目的识别片段的收集量被削减。本发明针对性地提供一种采集方法，即在监测区域的取样点等量采集表层、中层以及底层海水并混合，混合总量以2.5L为宜。水样用消毒后的采集器收集，采集后先用普通滤网（或消毒后的纱绢等）过滤，再用混合纤维素滤膜过滤，滤膜折叠沉没无水乙醇中冷冻保存。采集器的消毒方法为：先用次氯酸消毒，然后用无菌水冲洗，最后用紫外线灭菌。

提取总DNA可选择多种方法，本发明可提供下述方法：其一，将滤膜用无菌剪刀剪碎，通过珠磨式组织研磨器匀浆，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；其二，将滤膜放入无菌水中高速震荡10 min，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA；其三，将滤膜用无菌剪刀剪碎，CTAB缓冲液浸泡后，8000rpm离心10min，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA。其中，所述提取试剂盒优选为DNeasy Blood Tissue Kit，或者TIANampMarine Animals DNA Kit。

优选的，所述特异性引物的序列为：

正向引物，5'-CGCTTGGGCAGGAATAGTAGGC-3'；

反向引物，5'-GCTGGTCGTCTCCGATAAGTGT-3'。