[发明专利]一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用

说明书

一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域，为了提高大肠杆菌的耐酸性，本发明以大肠杆菌为出发菌株，过表达不饱和脂肪酸合成途径关键基因，羟脂酰‑ACP脱水异构酶基因fabA。制备获得酸耐受性提高的重组菌，进一步地，在上述获得的重组菌中过表达3HP的合成基因乙酰辅酶A羧化酶基因acc和丙二酸单酰辅酶A还原酶基因mcr，可用于生产3HP及其衍生物，解决了发酵过程中需要添加碱调节pH的问题，具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种酸耐受性提高的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌有一套精妙的系统在酸性环境下来维持细胞内的稳定pH，已知有五类酸抗性(acid resistance,AR)途径。目前对耐酸系统仍然知之甚少，但是AR1系统至少需要信号因子σs和cAMP受体蛋白(CRP)二者之一才能起作用。AR2-AR5路径分别依赖于细胞外谷氨酸，精氨酸，赖氨酸和鸟氨酸。实际应用中，有机酸发酵常以葡萄糖为碳源，导致AR1系统无法发挥功能，而AR2-AR5需要在培养基中额外加入氨基酸，造成发酵成本的增加，所以目前已知的5种大肠杆菌AR系统难以应用于有机酸发酵。

3-羟基丙酸(3HP)是一种三碳无旋光的有机化合物，分子内含羧基和羟基，是乳酸的同分异构体，因而3-羟基丙酸可作为多种有机物合成的前体物质，生产一些具有商业价值的化合物，诸如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸、丙内酯等。此外，它还是组成诸多大分子化合物和酯类聚合物的单体，可用于包装材料、金属润滑剂、纺织品抗静电材料、个人日常用品，及可吸收医用材料等。目前3HP的生物合成已经进行了大量研究，例如通过功能域拆分MCR为MCR-N和MCR-C两个蛋白，MCR-C端定向进化获得高活性突变体MCR-C(N940V/K1106W/S1114R)、更换启动子调控两个功能域表达平衡，最终构建MCR的重组质粒pETDuet-Plac,P2-51-mcrN-T7-mcrC(N940V/K1106W/S1114R)，与乙酰辅酶A羧化酶基因acc的重组质粒pACYCDuet1-acc共表达时，3HP的产量达到40g/L，是MCR途径合成3HP的最高报道(Changshui Liu et al,Functional balance between enzymes in malonyl-CoApathway for 3-hydroxypropionate biosynthesis[J].Metabolic Engineering 34(2016)104–111)。然而高浓度有机酸的积累会造成发酵液pH的降低，严重抑制工程菌株的生长。目前发酵过程中通常以自动添加碱液的方式维持发酵液的中性状态，生产结束后再添加大量的强酸来回收质子化的有机酸。大量酸碱的使用不仅增加了有机酸的生产成本，而且在发酵液中积累了高浓度的无机盐，产生难以处理的高渗透压废水。

发明内容

针对大肠杆菌酸耐受性差，以及3-羟基丙酸生物合成中出现的有机酸抑制菌株生长以及环境污染等问题，本发明提供了一种酸耐受性提高的重组菌，该重组菌过表达羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，所述羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，Genbank登录号为945568。

本发明还提供了上述重组菌的制备方法，是将羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA，连入表达载体，构建重组质粒，将构建好的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组菌。

进一步地限定，所述制备方法，步骤如下：

1)以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，通过PCR扩增获得羟脂酰-ACP脱水异构酶基因fabA的目标片段，并回收目标片段；

2)将步骤1)所得的fabA目标片段，通过SalI和NotI酶切后连接至经同样酶切后的表达载体pACYCDuet1，获得重组质粒pACYCDuet1-fabA；

3)将步骤2)所得的重组质粒转化至宿主细胞，获得重组菌。