[发明专利]用于富集纯化结核分枝杆菌的纳米磁珠的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于富集纯化结核分枝杆菌的纳米磁珠的制备方法，采用原硅酸四乙酯包裹Fe3O4磁性纳米粒子，后用γ‑氨丙基‑3乙氧基硅烷反应，制得表面含有大量氨基的磁性粒子，再用丁二酸酐接枝后，使其表面含有大量的‑COOH，最后在催化剂1‑乙基‑3‑(3‑二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺的作用下偶联上碱性品红分子，制备了功能性的纳米磁珠。采用本发明方法制备的纳米磁珠，用于富集纯化结核分枝杆菌，操作简单，无需离心操作；富集时间短，将纳米磁珠与结核杆菌结合10min，即可快速从痰液里分离结核分枝杆菌；且制备的纳米磁珠具有高度特异性，只分离结核分枝杆菌，不与其他杂菌反应，减少杂质干扰，染色背景干净。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于富集纯化结核分枝杆菌的纳米磁珠的制备方法及应用。

背景技术

肺结核是一种常见的呼吸系统传染性疾病，传播速度很快，若未能及时接受有效诊断及治疗，很容易引发结核杆菌感染其他脏器或系统，比如骨结核、肠道结核、肾脏结核，不仅带给患者较大痛苦，还能提高治疗难度，加速病情进展，延长治疗时间，增加脏器功能衰竭风险。随着我国医疗水平的不断深入发展，对肺结核防控力度的逐步加强，加上民众对于医疗卫生要求的逐渐提高，综合作用之下，很多结核患者获得了及时有效的治疗。但据医学调查显示，肺结核患者发病率仍然居高不下，现已成为全世界突出的公共卫生问题。

结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～0.4μm。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60％，特别是有大量分枝菌酸包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。分枝杆菌一般用齐尼抗酸染色法，以5％石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3％盐酸乙醇不易脱色。痰液标本里含有的结核杆菌数量很少，又掺杂了很多杂菌，直接涂片阳性率很低，需要对痰进行预处理，比如消化离心取沉渣，再涂片。

离心沉淀法一直以来均作为实验室筛查抗酸杆菌的主要手段，该方法通过对痰标本添加4％氢氧化钠进行消化，然后用离心机离心，去上清取沉渣涂片。离心虽然在直接涂片的基础上提高了阳性率，但结核杆菌离心沉降效率不高，当菌量少时不易富集。离心法富集标本中结核分支杆菌容易导致气溶胶，增加实验室感染危险，有安全隐患，且受离心机容量的限制，不能大通量进行。离心沉淀法处理后痰液中的杂质和未消化的部分也一起浓集沉淀到玻璃管底部并涂布于载玻片上，使镜下视野杂质较多，镜检较困难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供一种利用纳米磁珠富集纯化结核分枝杆菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种用于富集纯化结核分枝杆菌的纳米磁珠的制备方法，包括如下步骤：

(1)向装有Fe₃O₄纳米粒子(MNP)的容器中加入无水乙醇，室温下超声分散，再加入氨水加热搅拌反应，在搅拌的过程中缓慢滴加正硅酸四乙酯(TEOS)，持续反应10-12h，进行磁分离，用无水乙醇和去离子水交替清洗2-3次至溶液呈中性，60-80℃真空干燥得到Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子(MNP-TEOS)；

(2)将步骤(1)得到的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子超声分散在无水乙醇中，再加入蒸馏水和无水乙醇的混合液，在25-30℃水浴搅拌下缓慢加入γ-氨丙基-3乙氧基硅烷(APTES)，反应6-8h后，进行磁分离，用无水乙醇超声洗涤3-4次，60-80℃真空干燥得到表面氨基化改性的Fe₃O₄/SiO₂纳米粒子(MNP-TEOS-APTES)；