[发明专利]一种单核苷酸精度的tRNA甲基化高通量测序方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单核苷酸精度的tRNA甲基化高通量测序方法及其应用。本发明提供的tRNA甲基化高通量测序方法，通过富集小RNA和利用AlkB去甲基步骤实现高效率的tRNA逆转录，再结合硼氢化钠和苯胺介导的tRNA特异位点裂解，最终真正实现了m⁷G修饰位点的单核苷酸精度的tRNA高通量测序。具有灵敏度更高、特异性更强的优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种单核苷酸精度的tRNA甲基化高通量测序方法及其应用。

背景技术

tRNA甲基化修饰调控tRNA的折叠、稳定性、翻译功能，在正常生理活动和疾病发展中也具重要功能。然而，二代测序技术被广泛用于mRNA的转录组和表观转录组测序，缺乏有效的高通量测序手段检测tRNA特异性修饰。这是由于tRNA复杂的二级结构以及繁多的转录后修饰，干涉其基于逆转录的cDNA文库建立而导致的。

液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)是较为广泛的用于检测tRNA m7G甲基化修饰的方法，但是tRNA被消化成单核苷酸，LC-MS/MS只能提供样本的总m7G甲基化修饰水平，无法定位tRNA及修饰位点。

专利WO2016US35592公开了一种AlkB介导的RNA甲基化高通量测序技术(ARM-seq)，可用于tRNA修饰位点测序。该发明使用细菌来源的AlkB蛋白移除tRNA序列中大量的m¹A和m¹G甲基化修饰，保留了m⁷G修饰，从而提高tRNA的逆转录效率，建立有效的cDNA文库。此外，2015年有文献(DOI：10.1038/nmeth.3478)报道了一种同样利用AlkB蛋白的高通量测序技术——DM-tRNA-seq。但是，这种方法不能精确检测小RNA的特异性位点。

2018年12月，有文献(DOI：10.1002/anie.201810946)报道了一种总RNA的核苷酸水平的m⁷G和m3C修饰位点的测序方法——碱性水解和苯胺裂解测序(AlkAniline-Seq)。这种方法可以完成所有RNA的测序过程，但是无法实现特定RNA的表观转录组测序。

综上可知，现有技术中普遍存在无法定位及精确检测小RNA的特异性位点，特定RNA的表观转录组测序无法实现等缺点。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明公开的tRNA还原裂解测序技术，通过富集小RNA和利用AlkB去甲基步骤实现高效率的tRNA逆转录，再结合硼氢化钠和苯胺介导的tRNA特异位点裂解，提供了一种特异性更强、精确度更高的tRNA m⁷G修饰谱测序技术。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种单核苷酸精度的tRNA甲基化高通量测序方法，包括如下步骤：

S1、小RNA的提取和去甲基化；

S2、tRNA m⁷G位点的还原和裂解；

S3、cDNA文库的建立；

S4、利用生物信息学分析m⁷G修饰位点。

进一步地，所述步骤S1中小RNA提取的具体操作为：

(1)利用Trizol法提取总RNA，最终经稀释，得浓度为1-2μg/μL的RNA稀释液；

(2)取步骤(1)所得的浓度为1-2μg/μL的RNA稀释液25-50μL，利用mirVana miRNAIsolation Kit提取小RNA，并经1％的琼脂糖凝胶电泳验证RNA长度，均在200nt，即得。

进一步地，所述步骤S1中小RNA去甲基化的具体操作为：