[发明专利]一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT‑PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法以待检测样品的RNA为RNA模板，以牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒三种病毒的遗传特征设计的特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT‑PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒。本发明的有益效果在于：本发明的一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT‑PCR检测方法实现了准确、快速、高效的进行三种病毒性疾病RT‑PCR鉴别和诊断。

技术领域

本发明属于致病性病毒检测技术领域，具体涉及一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法。

背景技术

牛轮状病毒病是由轮状病毒引起的多种幼龄动物和婴幼儿的急性胃肠道传染病，以精神委顿、厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征。本病病原为轮状病毒，病毒粒子呈圆形，似车轮状。病毒对外界因素的抵抗力较强，在粪便和不含抗体的乳汁中，经半年仍有感染性。患者及隐性感染者的粪便内含有大量的轮状病毒，并可经消化道传染给易感人畜。在人和各种动物间有一定交互感染作用，只要病毒在人或一种动物中持续存在，就有可能造成本病在自然界中长期传播。本病主要发生在犊牛，发病日龄主要为15～90天。春、秋两季发病较多。病毒存在于肠道，随粪便排出体外，经消化道感染。轮状病毒有交互感染的作用，可以从人或一种动物传给另一种动物，只要病毒在人或一种动物中持续存在，就有可能造成本病在自然界中长期传播。

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科冠状病毒属。冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒，直径约80-120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。冠状病毒的一个变种是引起非典型肺炎的病原体，属于RNA病毒。冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60-200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。

牛病毒性腹泻(粘膜病)是由牛病毒性腹泻病毒引起的传染病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。临床症状：发病时多数牛不表现临床症状，牛群中只见少数轻型病例。有时也引起全牛群突然发病。急性病牛，腹泻是特征性症状，可持续1～3周。粪便水样、恶臭，有大量粘液和气泡，体温升高达40～42℃。慢性病牛，出现间歇性腹泻，病程较长，一般2～5个月，表现消瘦、生长发育受阻，有的出现跛行。

牛的轮状病毒、冠状病毒和病毒性腹泻三种RNA病毒，在日常的养殖过程中，属于多发疾病，而且有着相似的临床症状，仅仅根据临床症状很难进行区分，为临床确诊和治疗带来了一定的难度，所以需要开发有效的检测方法。现有技术中最快速有效的检测方法为RT-PCR，使用的具体技术为FastKing一步法RT-PCR试剂盒，但是这种方法存在一定的缺陷，根据试剂盒说明书提供的RT-PCR体系中只加入一对特异性的引物进行一种特异性的检查。对于这三种病的鉴别诊断或被检样品数量大，检测项目多的时候就需要耗费大量试剂、耗材与时间，给后续的琼脂糖凝胶电泳实验也带来相应的困难。

发明内容

为了克服现有的常规RT-PCR的不足,本发明提供一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，该检测方法不仅能减少了试剂与耗材的消耗、节省了大量的时间，而且能方便地实现被检样品对于牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒三种病毒性疾病的快速鉴别和诊断。