[发明专利]一种牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法有效
| 申请号： | 201910517811.1 | 申请日： | 2019-06-14 |
| 公开（公告）号： | CN110079637B | 公开（公告）日： | 2023-06-20 |
| 发明（设计）人： | 史量全;刘锴;马德慧;郭双;殷杰;王永强;赵志炎 | 申请（专利权）人： | 内蒙古民族大学 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11 |
| 代理公司： | 北京博尔赫知识产权代理事务所(普通合伙) 16045 | 代理人： | 于武江 |
| 地址： | 028000 内蒙古自治*** | 国省代码： | 内蒙古;15 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种牛 轮状病毒 冠状病毒 病毒性 腹泻 病毒 rt pcr 检测 方法 | ||
1.一种非诊断目的的牛轮状病毒、冠状病毒、病毒性腹泻病毒多联RT-PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法以待检测样品的RNA为RNA模板，以SEQ ID NO.1所示的牛轮状病毒的遗传特征、SEQ ID NO.2所示的牛冠状病毒的遗传特征、SEQ ID NO.3所示的牛病毒性腹泻病毒的遗传特征，分别设计特异性上游引物和特异性下游引物作为引物，进行RT-PCR扩增，得到扩增产物，之后将所述扩增产物经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并记录结果，根据电泳检测结果，判断待测样品中是否含有牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒；
所述检测方法采用的RT-PCR扩增体系为：25μL的2×FastKing One StepRT-PCRMasterMix，2μL的25×RT-PCR Enzyme Mix，1.25μL的上游特异性引物，1.25μL的下游特异性引物，5.5μL的待测样品RNA模板，加RNase-Free ddH2O至50μL；
所述特异性上游引物为10μM的牛轮状病毒上游引物、牛冠状病毒上游引物、牛病毒性腹泻病毒上游引物三种上游引物组成的混合物，所述特异性下游引物为10μM的牛轮状病毒下游引物、牛冠状病毒下游引物、牛病毒性腹泻病毒下游引物三种下游引物组成的混合物；
且所述牛冠状病毒上游引物序列5′-ATGGCATCCTTAAGTGGGCCGA-3′,所述牛冠状病毒下游引物序列5′-TTACACAGGTAGGGGTTCTATTGCC-3′；所述牛轮状病毒上游引物序列5′-ATGTCTCAGTATTGACGTGACGAGTCT-3′，所述牛轮状病毒下游引物序列5′-CTACAATCGATCAGTTGCATTGCG-3′；所述牛病毒性腹泻上游引物序列5′-ATGGAGTTGATCACAAATGAACTTTTATACA-3′，所述牛病毒性腹泻下游引物序列5′-GCAACTTGTGACCCATAGAGGGC-3′；
所述检测方法采用的RT-PCR扩增条件为：42℃30min，95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，45个循环；70℃5min，4℃保存备用。
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