[发明专利]一种检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒、检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒、检测方法及其应用，所述引物组合物包括针对NR21、NR24、NR27、BAT25、BAT26、MONO‑27、Penta D、Penta E和Amel的引物对SEQ ID NO:1～18。本发明针对NR21、NR24、NR27、BAT25、BAT26和MONO‑27六个SNP位点设计引物，根据六个SNP位点的状态，评价微卫星不稳定性，同时根据Penta D、Penta E和Amel三个对照多态性位点，评估待测组织样本及其对照的一致性，准确性高，使用的样本量少，扩增效率高，条带清晰，灵敏度高。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及一种检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术

微卫星(Microsatallite)是指由1～6个碱基的短链DNA组成的串联重复序列，在基因组中广泛存在。与正常组织相比，肿瘤组织内的微卫星由于重复序列的插入或缺失导致微卫星长度的改变，形成微卫星不稳定性(Microsatallite Instability，MSI)。研究表明，造成MSI的原因是由于DNA错配修复(MMR)基因(如MLH1、MSH2和MSH6)的突变或超甲基化修饰，导致基因DNA在细胞中复制时出错。

MSI与肿瘤的发生密切相关，在结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等多种癌种中均可以检测到MSI阳性。MSI在结直肠癌中发生最为频繁，近15％的偶发性结直肠癌和遗传非息肉病性结直肠癌患者含有MSI特征。对于偶发性结直肠癌，MLH1启动子的高甲基化造成MMR功能异常，引起MSI，此类患者约占所有结肠癌患者的12％，易发生在无明显家族遗传史的老龄化个体中，其MMR缺陷直接发生在结直肠癌体细胞中。与此不同的是，遗传非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，又称Lynch综合症，因生殖细胞中携带MMR基因突变，导致MMR功能缺陷，引起MSI，该疾病是一种家族遗传性疾病，占所有结直肠癌患者的2％-5％。

结直肠癌是MSI发生最为频繁的癌症，MSI检测最早作为结直肠癌的生物标记物。自2013年起，美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的2013v.1版结直肠癌指南，首次推荐进行MSI检测。最新的2019v.1版NCCN指南推荐有结直肠癌病史的患者进行MMR或MSI筛查；高频MSI(MSI-H)的结直肠癌II期病人具有较好的预后，但不能在5-FU治疗中获益；同时MSI还可以应用于林奇综合征患者的诊断。此外，MSI也是良好的免疫治疗标志物。FDA已经批准三种针对MSI症状的免疫治疗药物。例如，NCCN推荐PD-1免疫治疗单抗pembrolizumab和nivolumab用于dMMR/MSI-H结直肠癌晚期治疗。

CN108998536A公开了一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒及其检测方法，包括检测人类微卫星不稳定性状态MSI的引物、探针。该引物、探针能够检测人类微卫星不稳定性状态MSI，灵敏度高，特异性强；本发明还提供了一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人类微卫星不稳定性状态；此外，本发明提供了使用上述试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。然而，多种上游引物的5’端修饰有相同的荧光基团，对结果分析造成影响。

因此，提供一种灵敏度高、准确性高、步骤简便、成本较低的微卫星不稳定性的检测引物组合物、试剂盒和检测方法，在癌症治疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测微卫星不稳定性的引物组合物、试剂盒、检测方法及其应用，所述方法基于多重荧光PCR和毛细管电泳技术，对MSI状态进行检测，有利于对结直肠癌患者及其他癌症患者提供临床治疗和用药指导。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：