[发明专利]一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明通过对枯草芽孢杆菌染色体上MK‑7生物合成途径相关基因的改造，构建得到14株重组菌BS1～BS14，其中BS6～BS14使得MK‑7的产量得到了显著提高，最高可达33.5mg/L，是原始菌株的野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的产量的3.53倍。本发明还提供了一种改造微生物中MK‑7生物合成途径提高MK‑7产量的方法，为构建MK‑7的高产菌株提供了理论依据。

技术领域

本发明涉及一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

维生素K是一类重要的脂溶性维生素，作为γ-谷氨酸羧化酶的辅因子，通过激活基质Gla蛋白，让更多的钙沉积到骨骼里，让更少的钙沉积到软组织(尤其是血管)里，促进骨骼的发育和健康，能逆转骨质疏松。比如能帮助“骨钙素”和必要的矿物质结合起来。保护血管，防止动脉粥样硬化和心血管疾病。除了能让钙少沉在血管里，它还能让脂蛋白和白细胞少堆积在血管壁上，还能降低血管平滑肌细胞的死亡率——当得上“血管卫士”之名。

维生素K是一系列化合物的总称，其核心结构是2-甲基-1,4-甲萘醌环，但是侧链结构的长度和饱和度有所不同。维生素K在自然界中包含两种形式：维生素K1和维生素K2。其中维生素K2具有很多种亚型，特点是含有一个可变的侧链结构，由不同数量的异戊二烯基组成，这类维生素可以简称为MK-n，M代表甲萘醌，K代表维生素K，n代表异戊二烯基的数量，最常见的是MK-4和MK-7。在血液中MK-7比MK-4具有更长的半衰期，能够更好的被生物利用。因此，由于其半衰期长、生物利用度好，MK-7在食品、制药和保健行业更受欢迎，被广泛用作膳食补充剂或药物，用于治疗骨质疏松症、动脉钙化、心血管疾病、癌症和帕金森精神病等。

采用化学合成的七稀甲萘醌(MK-7)分子中的异戊二烯侧链多为顺式结构，且副产物多，原料来源受到限制，已经逐步被生物发酵法所替代。但目前生物发酵法生产MK-7多局限于利用纳豆芽孢杆菌固态发酵纳豆，此种工艺需要对纳豆进行前处理，工艺步骤多，发酵周期长，并且后期提取复杂，产品纯度不高。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)常被广泛用在食品酶制剂及重要营养化学品的生产中，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是高效合成MK-7的有效途径。然而，MK-7的合成途径十分复杂，且枯草芽孢杆菌合成MK-7的代谢流通量不足，将严重影响MK-7的合成。如何调整枯草芽孢杆菌代谢流供给，增加MK-7的合成是一个值得深入探讨的问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种提高七稀甲萘醌产量的重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为出发菌株，利用P₄₃启动子替换染色体上甲基萘醌异分支酸合成酶基因menF和二羟基萘甲酸合成酶基因menB的天然启动子；利用P_hbs启动子替换染色体上O-琥珀酰苯甲酸-CoA连接酶基因menE、转酮酶基因tkt的天然启动子；用P₄₃启动子在染色体上表达外源异分支酸合酶entC基因、外源磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsA基因，并敲除染色体上的葡萄糖磷酸转运酶基因ptsG；所述P₄₃启动子的序列如SEQ ID NO.3所示；所述P_hbs启动子的序列如SEQ ID NO.5所示。

在一种实施方式中，所述menF基因的序列如genebank ID：937190所示；所述menB基因的序列如genebank ID：937195所示；所述menE基因的序列如genebank ID：937132所示；所述tkt基因的序列如genebank ID：937377所示；所述entC基因的序列如genebank ID：945511所示；所述ppsA基因的序列如genebank ID：946209所示；所述ptsG基因的序列如genebank ID：939255所示。