[发明专利]一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法

说明书

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法，公开了其培养基配方及发酵过程各控制参数。将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大培养，获得种子液；种子液接种至发酵罐基础培养基中进行高密度培养，分批次流加补料培养基至培养结束。本发明通过优化基础培养基与补料培养基组成、控制补加补料培养基的流速与补料量，获得高产甘精胰岛素的同时将质粒丢失率控制在10％以内，电泳表达量在34％以上。本发明的甘精胰岛素高密度发酵提高了生产效率，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种用于生产甘精胰岛素的培养基及发酵方法。

背景技术

发酵研究的主要目标在于使用高生产率技术使目的产品产生良好的成本效益。由于大多数蛋白在重组大肠杆菌中属于细胞内累积，故生产率与终细胞密度及单位生产率成正比关系。高密度发酵不仅可以提高生产率，还能降低培养容积、生产成本及设备投资，同时便于下游加工、减少废水排放，故高密度培养成为近年来发酵工业重要目标与方向之一。

Pan(Adv Biochem Eng Biotechno，2003；85：43-93)等通过恒速流加培养，生产人生长激素，菌体OD600值达到120；Allen(Biophanmacology，1987；1：38-419)等曾用合成培养基培养重组大肠杆菌，菌密度达到了79g(DCW)/L，但外源蛋白没有表达；Jung(Ann InstPasteur Microbio，1988；139：129-146)等采用该技术生产干扰素，菌体浓度达到46g(DCW)/L，干扰素比生产率为17mg/g菌体；周宇荀(生物工程学报，2005，21(4)：615-625)等抗菌肽基因工程菌最高发酵密度达到OD600＝119，菌体浓度达到40g/L(DCW)，而目的蛋白表达量仅为5％左右，并有40％的工程菌丢失了质粒。变流速或梯度增加流加速度可以在菌体密度较高的情况下通过加入更多的营养物质促进细胞的生长，并对产物的表达有利。李民(生物工程学报，1998，14(3)：270-276)等采用三阶段式流加葡萄糖的方式，高密度培养重组菌YK537/pDH-B2m生产骨形成蛋白(BMP-2A)，发酵密度达OD600＝53，BMP-2A产量为2.78g/L。

基因工程菌在发酵过程中重组质粒会出现一定的不稳定性，将导致得不到预期的目的基因产物及产量。质粒的不稳定性分为DNA片段发生重组、缺失或插入的结构性不稳定和细胞分裂时质粒未进入子细胞的分离不稳定。质粒的稳定性受到宿主和质粒的基因型、宿主和质粒的相互作用、基因表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响。基因工程发酵通常需要高密度菌体培养，以获得更多的目的产物，然而过高的菌体密度会影响工程菌的质粒稳定性。

工程菌高密度培养是获得外源基因表达产物的重要手段，但高密度培养的主要障碍之一是代谢副产物乙酸的积累。随着发酵培养密度的提高，乙酸的积累增加，并直接影响菌体的生长和外源蛋白的表达，逐渐成为制约工程菌高密度培养的重要因素。Jensen(Biotech Bioeng，1990；36：1-11)等报道当培养液中乙酸浓度大于6g/L时，乙酸会明显抑制菌体生长；当乙酸浓度大于2.4g/L时，会显著降低比产率。Konstan(Biotech Bioeng，1990；36(1)：750-758)等报道培养液中乙酸浓度大于15g/L时菌体生长就完全停止了。Boon(Biotechnol Letts，1992；14(12):1115-1118)等人利用从大肠杆菌衍生的三株宿主菌与对应的重组菌做乙酸抑制实验，发现重组菌比宿主菌更容易受到乙酸的抑制。

CN104726524A公开了一种培养基及用该培养基发酵生产甘精胰岛素前体的方法，通过添加盐类和微量元素来降低有害代谢产物(主要是乙酸)的积累，改善细胞生长，增加菌体得率，虽然产量有所提升，但仍不理想；CN106282274A公开了一种胰岛素前体蛋白的毕赤酵母高密度发酵方法，CN107022591B公开了一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，均属于高密度发酵，但需发酵培养130h以上，发酵周期长。