[发明专利]一种快速检测CSFV、GETV、JEV的多重RT-PCR引物组及检测方法

权利要求书

1.一种用于快速检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR引物组，其特征在于，所述的多重RT-PCR引物组是由用于检测CSFV的引物、用于检测GETV的引物和用于检测JEV的引物组成，其中，

用于检测CSFV的引物的核苷酸序列为：

上游引物C-F：5’-GTCAACCAATGAGATAGG-3’；

下游引物C-R：5’-GGCAGACAAGGTAGAAAG-3’；

用于检测GETV的引物的核苷酸序列为：

上游引物G-F：5’-TTCCGATGGCATGATAAA-3’；

下游引物G-R：5’-GGGACAAACGAGGAGGTG-3’；

用于检测JEV的引物的核苷酸序列为：

上游引物J-F：5’-ACTTGGGTGGACTTG-3’；

下游引物J-R：5’-GGAGCATTGGGTGTT-3’；

所述的检测不以疾病诊断和/或治疗为目的。

2.权利要求1所述的多重RT-PCR引物组在制备检测CSFV、GETV和JEV的试剂中的应用。

3.含有权利要求1所述的多重RT-PCR引物组的试剂盒，该试剂盒的应用不以疾病诊断和/或治疗为目的。

4.一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：合成权利要求1所述的用于检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR引物组；

步骤2：提取待检测样品的总RNA，然后以提取的总RNA为模板进行反转录，得到cDNA；

步骤3：以反转录得到cDNA为模板，采用步骤1合成的多重RT-PCR引物组进行PCR扩增反应；

步骤4：分析PCR扩增产物，结果判定；

所述的多重RT-PCR方法不以疾病诊断和/或治疗为目的。

5.根据权利要求4所述的一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤2中所述反转录的反应体系为：RNA模板与20μmol/L的随机引物各取2μL，RNasefree dH₂O 10μL，10mmol/L dNTPs 1μL，5×M-MLV buffer 4μL，RNA酶抑制剂（40U/μL）和反转录酶M-MLV（200 U/μL）各0.5μL；所述反转录的反应条件为：30℃10min，42℃1h，70℃15min，4℃5min。

6.根据权利要求4所述的一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤3中所述PCR扩增反应的反应体系为：上游引物G-F、下游引物G-R、上游引物J-F、下游引物J-R以及上游引物C-F、下游引物C-R各0.5μL，各引物的终浓度为0.4mmol；2×ESTaq Master Mix酶12.5μL；cDNA模板各1μL；灭菌后ddH₂O补足至25μL；所述PCR扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30sec；52℃退火30sec；72℃延伸20sec；35个循环；最后72延伸10min。

7.根据权利要求4所述的一种用于同时检测CSFV、GETV和JEV的多重RT-PCR方法，其特征在于，步骤4中所述分析PCR扩增产物是对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中病毒的种类。