[发明专利]一种突变型草甘膦降解酶及其克隆、表达与应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种通过定点突变技术获得的对草甘膦催化活性和底物特异性提高的草甘膦降解酶突变体。本发明所述的草甘膦降解酶突变体B4S7‑F63X，在现有草甘膦降解酶B4S7的基础上，改造后的草甘膦降解酶在其第63位的苯丙氨酸进行突变为丙氨酸或组氨酸。对比现有的文献报道和专利数据，B4S7‑F63A对草甘膦具有最高的催化效率，B4S7‑F63H对草甘膦具有最高的底物特异性，所述草甘膦降解酶编码基因导入植物后，有望赋予植物抗草甘膦的同时，实现草甘膦的高效分解，解决草甘膦在植物中的残留问题，在培育新型耐草甘膦作物及培育能够降解草甘膦的新型抗除草剂植物领域具有极大的应用潜力。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种通过定点突变技术获得的对草甘膦催化活性和底物特异性提高的草甘膦降解酶突变体，并进一步公开了该突变体及其编码基因在新型耐草甘膦作物的培育以及草甘膦污染生物降解领域中的应用。

背景技术

草甘膦(商品名为Roundup)又名N-磷酸亚甲基甘氨酸(N-(phosphonomethyl)glycine，GLP)，其分子式为C₃H₈NO₅P，相对分子量为169.1，草甘膦与甘氨酸结构类似，属于甘氨酸的衍生物。草甘膦是白色固体，无挥发性，其熔点高(200℃)、稳定性好、在水中溶解度低(1.2％，25℃)。草甘膦是一种非选择性、高效除草剂，在全球应用广泛，也是目前全球使用量最大的农药。草甘膦除草剂通常采用草甘膦的各种盐制剂(如草甘膦异丙胺盐、草甘膦钾盐等)应用，从而提供更加强烈的除草效果。此外，加入一些表面活性剂和增效剂成分可以使草甘膦对植物的渗透性增强。

在植物体内，由于芳香族氨基酸会参与维生素、生物碱和吲哚衍生物等多种物质的合成，并在蛋白质合成、细胞分裂等过程中发挥重要的生物功能。因此，生物体内芳香族氨基酸的减少会严重干扰植物的正常代谢，并进而影响植物的生长发育(向文胜,张文吉etal.2000)。研究表明，莽草酸途径对于植物芳香族氨基酸的生物合成具有极其重要的地位，而这一途径的关键酶是5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，该酶以PEP和3-磷酸莽草酸(shikimate-3-phosphate，S3P)为底物，催化合成5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)；随后分支酸合成酶催化EPSP形成芳香族氨基酸的前体物分支酸。草甘膦作为PEP的结构类似物，其在进入植物体内后会竞争性结合EPSPS，进而影响了EPSPS与PEP之间的正常结合，从而抑制EPSPS的活性，阻断莽草酸途径，导致次生产物代谢失调，使得植物的生长发育因此受到抑制甚至死亡，最终达到去除杂草的效果。草甘膦作为一种非选择性、高效除草剂，其在农业应用中发挥着重要的作用，但随之带来的确是不得不面对的安全隐患，其一即是如何解决植物中草甘膦降解的问题，其二即是由于草甘膦的非选择性除草作用导致的农作物损失。