[发明专利]基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法

说明书

本发明公开了基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法。本发明利用RNA干扰抑制FOH合成的竞争途径，即作为番茄红素合成关键酶的八氢番茄红素合成酶基因psy的转录，进而抑制番茄红素合成酶的表达水平，达到阻遏FOH竞争代谢途径的效果，使更多的碳通量集中于FOH合成，从而强化了FOH的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种基因工程化类球红细菌、其制备方法以及利用类球红细菌生产法尼醇的方法。

背景技术

倍半萜是一个庞大而多样的自然科学家族，倍半萜类化合物是异戊二烯类化合物中种类最丰富的一类，含有7000多种特征化合物，在医疗和工业方面发挥着重要作用。(E,E)-法尼醇(1-羟基-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯，C₁₅H₂₆O，缩写FOH，英文Farnesol，又称：金合欢醇)是一种具有甜油性气味的无环倍半萜烯醇，广泛分布于许多植物精油中。法尼醇(FOH)具有多种生物学功能，例如信号转导、群体感应、细胞增殖、细胞凋亡和真菌菌丝抑制，可以作为杀菌清洁剂、杀虫剂、昆虫引诱剂。它也被开发为抗癌药物和精神抑制药物的重要原料。法尼醇由于其蕴含高能量和低吸潮性的特性，使其具有开发成为生物燃料潜力，可以作为柴油或喷气燃料替代品。

目前法尼醇的生产大多从植物中提取，但是通过植物提取的方法存在如下问题：很难满足工业化利用的大量需求；天然原料消耗巨大，对植物等自然资源有很大的影响；FOH的提取和纯化成本十分的高昂，所以单靠从天然原料中直接分离获得FOH并不是长久之计。利用微生物发酵合成的手段生产法尼醇是最近几年出现的新兴发展技术。微生物合成具有的优势在于微生物的发酵周期短、发酵培养过程简单、产物提取和纯化步骤简单等，利用微生物合成萜烯类化合物如法尼醇，是目前工业化生产的理想途径。

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)属于红假单胞菌属，紫色非硫细菌的α亚群，是一种革兰氏阴性细菌，属于光合细菌的一种。类球红细菌菌体的正常形态一般为球型或是卵型。类球红细菌是一种拥有极高工业生产价值的菌株。已经有多项研究表明，类球红细菌能够合成多种高附加值的生物活性物质，例如类胡萝卜素、八氢番茄红素、CoQ₁₀、超氧化物歧化酶等，是极具工业开发潜力的微生物。类球红细菌的代谢方式多种多样，在有碳源或其他能利用的有机物存在的情况下，类球红细菌能进行光能异养。在无氧条件下，它能固定二氧化碳作为碳源实现光能自养；在黑暗的有氧条件下，它还能利用多种有机物实现化能异养。

目前已公开了使用类球红细菌培养进行法尼醇发酵生产的方法，例如，CN107119001A公开了一种基因工程化类球红细菌及其制备方法和法尼醇的生产方法。其通过将来自于鼠疫耶尔辛杆菌Yersinia pestis CO92的磷酸酶PgpB基因转化到类球红细菌能够在胞内表达，并产生具有活性的磷酸酶PgpB，从而直接催化类球红细菌MEP途径积累的焦磷酸法尼酯生成法尼醇。但是目前国内外利用微生物生产法尼醇的报道仍然很少。本领域内仍然需要微生物合成法尼醇的新方法。

发明内容

本发明利用RNA干扰的方法，对FOH的一个竞争旁路即番茄红素合成途径的关键酶-八氢番茄红素合成酶基因(psy)进行干扰，有效抑制番茄红素合成酶(PSY)的表达水平，从而更多的代谢通量促进FOH的合成。至少基于上述部分内容完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种基因工程化类球红细菌，其包含干扰八氢番茄红素合成酶mRNA的至少一个片段的至少一种干扰核酸，从而使得所述八氢番茄红素合成酶基因的转录和/或表达受到抑制，并由此强化类球红细菌产生FOH的能力。

根据本发明的基因工程化类球红细菌，优选地，所述干扰核酸包含SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的序列。进一步优选地，所述干扰核酸包括于质粒载体内。

本发明的第二方面，提供一种基因工程化类球红细菌的制备方法，其包括：