[发明专利]一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用

说明书

本申请公开了一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。本申请的试剂盒包括用于高通量测序检测PTEN、BRAF、PIK3CA和FGFR2四个基因突变情况的引物组合。本申请的试剂盒，灵敏度高、特异性强能有效提升血尿病人膀胱癌的检出率、提升早期发现率，提升病人5年生存率。采用本申请的试剂盒进行膀胱癌辅助筛查，以尿液为检测样本，取样方便，属于无创检测，能提升受检者的接受程度，有利于扩大膀胱癌筛查的覆盖人群，降低中国膀胱癌发生率，为全民健康提供保障。更为重要的是，采用本申请试剂盒进行筛查，可以有效避免阴性患者因行膀胱镜带来的尿路感染、尿路损伤等风险，提高患者的依从性，从而改善就医体验与医患关系。

技术领域

本申请涉及膀胱癌基因检测领域，特别是涉及一种用于膀胱癌辅助诊断或筛查的试剂盒及其应用。

背景技术

膀胱癌是泌尿液系统最常见的恶性肿瘤，占我国泌尿液生殖系肿瘤发病率的第一位。2015年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病数约为8.03万，恶性肿瘤死亡数约为3.29万，发病率和死亡率随年龄增长而增加。血尿液是膀胱癌最常见的症状，研究发现12％的血尿病人经检查发现是膀胱癌。

目前临床应用的血尿检查一般有尿常规、B超、尿液脱落细胞学检查和膀胱内窥镜检查等。膀胱内窥镜检查被视为膀胱癌诊断的金标准，但膀胱镜检查可能导致如尿路感染、尿道损伤、膀胱损伤等负面影响。普通膀胱镜检通常令患者十分痛苦，患者依从性差；而无痛膀胱镜检查仍然会有麻醉风险，且收费较高，也无法避免尿路感染等负面影响的风险。超声检查虽然不会有膀胱内窥镜检查的负面作用，但是其灵敏度只有60-75％，特异度只有40-85％，无法准确筛查出癌症患者。

因此，无创的尿液标志物检测可作为膀胱癌辅助诊断或筛查非常好的参考方法。目前，无创的膀胱癌尿液标志物检测主要包括尿液脱落细胞学检查、荧光原位杂交技术和尿液蛋白检测。尿液脱落细胞学检查具有无创伤、特异性高、非侵入性的优点，但是其敏感性为13％-75％，特异性为85％-100％，且受多种因素影响。荧光原位杂交(FISH)技术也是一种尿液无创检测方法，检测3号、7号、17号染色体以及9号染色体的变异情况来辅助诊断膀胱肿瘤，有助于术后监测及评估复发危险性。目前膀胱癌诊断临床应用的FISH技术灵敏度达到90.78％，然而特异性较低，只有82.35％，其特异性与脱落细胞学检查没有统计学差异。无创的尿液蛋白检测，例如膀胱肿瘤抗原(Bladder tumor antigen,BTA)检测，采用化学发光法定量检测尿液中的BTA，灵敏度只有76.7％，特异度90.9％。另一种无创的尿液蛋白检测，尿核基质蛋白22(Nuclear matrix protein 22,NMP22)检测，北大吴阶平泌尿外科多中心临床试验证明胶体金法检测NMP22，其敏感性也只有69.6％，特异性84.9。美国FDA已经批准BTA Stat、BTA、Trak、NMP22、ImmunoCyt和FISH用于膀胱癌的诊断和术后随诊检查，其中ImmunoCyt是一种免疫细胞学检查。上述方法除FISH以外均已应用多年，总的来看，仍存在敏感性和特异性不足的问题。因此，有必要寻求一种新的灵敏度更高、特异性更强的无创的膀胱癌肿瘤检测方案。

高通量测序推动了基因测序行业发展，同时也极大地拓展了基因检测在精准医疗领域的应用。肿瘤液体活检由于其在检测肿瘤、辅助治疗方面的明显优势，被列为2015年十大突破技术之一，检测对象包括CTC、cfDNA、外泌体等。其中，cfDNA即游离DNA(Cell-freeDNA，cfDNA)，又称循环DNA，是存在于血液、尿液中游离于细胞外的DNA。cfDNA中来自肿瘤基因组的游离DNA片段，称为ctDNA；ctDNA与肿瘤细胞本身的DNA特点存在一致性，能够反映肿瘤的特征性改变。通过检测体液中的游离DNA的变异，例如突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等，可反映肿瘤组织的克隆特点，作为判断肿瘤良恶性，肿瘤疗效观测，复发监测的有效手段。cfDNA作为一种新型的诊断标志物，其应用价值在多种实体肿瘤中得以证实。cfDNA的无创性和易获得性，是液体活检的重要方式，被认为可以用于检测肿瘤早期诊断，进展过程，预后判断及个性化用药指导，是精准医疗的必备手段。