[发明专利]检测副溶血弧菌的RT-qsCPA引物及其试剂盒和方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及检测副溶血弧菌的RT‑qsCPA引物及其试剂盒和方法。该RT‑qsCPA引物包括如下序列：外引物4s、外引物5a、内引物3a、内引物2a、交叉引物CP。本发明首次利用单交叉引物设计实时荧光单交叉定量CPA方法检测副溶血弧菌，用5条引物不同组合加入定量反应体系中，通过测定荧光曲线、熔解曲线及琼脂糖凝胶电泳证明该体系的可行性。本发明具有良好特异性、灵敏度高、检测快速等优点。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及检测副溶血弧菌的RT-qsCPA引物及其试剂盒和方法。

背景技术

副溶血弧菌是一种引起食源性肠胃炎的主要致病病原体。1953年，日本学者从一名食物中毒患者身上分离得到，其普遍存在于江河和海洋中，可从不同海产品中分离得到，如牡蛎、扇贝、章鱼、虾、蛤、蟹、鲭鱼、沙丁鱼、鳕鱼等。随着我国进出口贸易的快速发展和海产品、禽畜类产品等进出口量的增长，副溶血弧菌成为进出口产品质量安全检验的重要检测目标，而传统的分离鉴定法操作繁琐、耗时较长、工作量巨大。因此，亟需开发快速、高灵敏、简便的副溶血弧菌检测方法。近年来，鉴定副溶血弧菌的方法不断发展，主要有免疫学方法、PCR及其衍生技术、等温扩增技术、基因芯片等。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过检测荧光量来实现定量检测。多重RT-qPCR可同时检测多种菌株，或副溶血弧菌的多个基因的实时表达水平，且无需电泳表征，大大提高了检测效率。这种检测技术用时短、特异性好、灵敏度高、重复性好，目前多用于实验室和进出口食品的检测中。

CPA方法是一种新型的等温扩增技术，该技术利用多个引物和探针进行等温扩增反应，其中一个或两个引物为交叉引物。根据交叉引物的的数量分为单交叉引物扩增和双交叉引物扩增。单交叉引物扩增技术(sCPA)的引物一般为5条，包括1条交叉引物，2条外引物(剥离引物)，2条内引物(正向引物)，并利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下反应一小时，即可特异、快速、高效地完成核酸扩增反应。鉴于CPA技术有众多优势，现已在疾病分子诊断、致病菌检测、病毒检测等领域广泛应用。目前，还未见针对副溶血弧菌的CPA检测技术。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了检测副溶血弧菌的RT-qsCPA引物及其试剂盒和方法。该方法实现了对副溶血弧菌的检测，具有快速、操作简单、准确等特点，能够满足条件较差的基层实验室进行快速检测的需求。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种RT-qsCPA引物，该RT-qsCPA引物包括如下序列：

外引物4s：序列如SEQ ID NO：1；

外引物5a：序列如SEQ ID NO：2；

内引物3a：序列如SEQ ID NO：3；

内引物2a：序列如SEQ ID NO：4；

交叉引物CP：序列如SEQ ID NO：5。

本发明以副溶血弧菌为研究对象，利用NCBI数据库，筛选出了副溶血弧菌特异基因的序列。同时首次利用单交叉引物恒温扩增技术，并结合实时荧光定量技术，建立了实时荧光定量单交叉引物扩增(RT-qsCPA)方法，实现了对副溶血弧菌的检测，具有快速、操作简单、准确等特点，能够满足条件较差的基层实验室进行快速检测的需求。

本发明还提供了该RT-qsCPA引物在制备副溶血弧菌检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种副溶血弧菌检测试剂盒，包括如下组分：包括上述RT-qsCPA引物。

在本发明中，副溶血弧菌检测试剂盒还包括dNTPs、甜菜碱、MgSO₄、核酸染料、缓冲液、Bst DNA聚合酶、SiO₂及水。