[发明专利]基因表达解析方法、基因表达解析用设备及基因表达解析装置

说明书

本发明涉及基因表达解析方法、基因表达解析用设备及基因表达解析装置。本发明的基因表达解析方法对包含组织或多个细胞的样品中的各个细胞中的生物体分子分别进行解析，该方法包括：将所述样品载置在支撑体上的工序；在所述支撑体中，核酸探针在支撑体表面或表面附近2维地分布并被固定，使所述样品的作为靶的被检核酸与该核酸探针杂交的工序，所述核酸探针包含被检核酸捕捉用序列和具有已知序列且根据在支撑体表面或表面附近的位置的不同而不同的细胞识别用标签序列；进行与上述被检核酸互补的DNA链的合成，制作由包含上述标签序列的DNA互补链构成的cDNA文库的工序；以及对上述cDNA文库的全部或一部分进行核酸扩增的工序。

本申请是申请日为2012年7月30日，申请号为201280074958.4，发明名称为《带标签序列的2维cDNA文库设备、以及使用其的基因表达解析方法及基因表达解析装置》的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于解析细胞中的基因表达的方法、设备及装置。

背景技术

基因表达解析中使用如下方法，即，从细胞群中获取mRNA并制作作为其互补链的cDNA，用PCR等扩增其拷贝数，使用DNA探针阵列(DNA芯片)在与靶对应的探针位置将其捕获，并进行荧光检测。但是，使用PCR扩增和DNA芯片的方法的定量分析精度低，期待精度高的基因表达谱分析方法。最近期望从1个细胞提取mRNA并进行定量分析的方法。作为定量性良好的分析方法，虽然有定量PCR，但其为如下方法，即准备具有与靶相同的DNA序列的标准试样，在相同条件下进行PCR扩增，用荧光探针监视扩增的进行情况并进行比较，从而进行定量分析的方法。在靶为1个细胞时，原本mRNA数量就少，难以进行定量分析。此外，为了进行多个基因表达的定量分析，需要将试样分割并各自独立地进行定量分析。在作为对象的基因数多、包含表达量少的基因时，还可能由于试样分割而无法测定。

在这样的状况下，本发明人所在的研究组考察了下述方法，即，制作将全部mRNA变换为cDNA并保持在珠上的cDNA文库(包含全部cDNA的cDNA集合体)，将其用于定量分析。该方法显示，通过cDNA文库的重复利用避免了试样分割所致的微量表达基因的测定错误，可以正确地测定1个细胞中包含的多个基因的表达量。

此外，开始使用下述方法，即，将单个细胞中的微量mRNA通过逆转录变换为cDNA，使用PCR扩增而进行核酸扩增后，使用大规模DNA测序仪对该扩增产物进行测序，并统计测序结果，从而对扩增后的核酸序列数进行计数，由此推定mRNA分子数(非专利文献1)。该方法能够测定的基因数的上限取决于大规模DNA测序仪的并列数，因此原理上不仅能够测定2万几千种的全部的基因，而且还能够通过计数测定包括剪接变体在内的十万种序列。此外，在多个反应槽的每一个中各插入一个细胞，将用于识别细胞的标签序列在液相下导入反应槽中作为试剂，PCR扩增后将这些扩增产物集中到一起，用大规模DNA测序仪进行序列解析，此时通过参照标签序列即能够鉴定出测序得到的扩增产物原来所在的细胞(非专利文献1)。

另一方面，PCR扩增时存在基因不同使得扩增率不同的扩增偏倚(bias)问题。非专利文献2中提出如下方法，即由mRNA进行逆转录时引入随机序列，对该序列和靶cDNA同时进行序列解析，从而从数据中去除在引入随机序列后进行的PCR扩增时发生的PCR偏倚的影响(非专利文献2)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Islam，S.等、Genome Research Vol.21，No.7，pp.1160-1167，2011年

非专利文献2：Kivioja，T.等、Nature Methods，Vol.9，No.1，pp.72-74，2011年

发明要解决的课题

如上所述，期望对构成组织的一个一个的细胞的内含物进行定量分析、以保存组织的2维信息的形态定量监视各种基因的表达量。