[发明专利]一种基于RPA-侧流层析技术检测栗黑水疫霉的引物和探针组合及其应用

说明书

本发明公开了一种基于重组酶介导等温扩增‑侧流层析技术(RPA‑LFD)检测栗黑水疫霉(Phytophthora cambivora)的引物及探针组合及其应用。采用所述引物及探针组合检测栗黑水疫霉(P.cambivora)的具体方法为：1)提取待测样本DNA；2)以DNA为模板，进行RPA扩增；3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。本发明所使用的引物及探针组RPA扩增效果好，条带特异性强，与其他病菌无交叉反应，在质控区有阳性对照，增加了检测的灵敏性，为栗黑水疫霉(P.cambivora)的检测提供了新的技术平台，同时适用于栗黑水疫霉病菌寄主苗木、插枝等植物材料及其土壤和介质中的栗黑水疫霉(P.cambivora)进行检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于RPA-LFD检测栗黑水疫霉的方法，以及专用引物及探针组合。

背景技术

栗黑水疫霉(Phytophthora cambivora)属于卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)。栗黑水疫霉主要危害寄主的根、茎，引发树木的多种病害，如栗树的黑水病，桃树的根腐病，挪威槭的茎溃疡病等。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低疫病引起的损失。

为了阻止栗黑水疫霉(P.cambivora)传播范围的不断扩大，使栗黑水疫霉根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。栗黑水疫霉的传统检测方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期作出诊断；从土壤中分离病原菌可能会同时得到多种病原菌和非病原菌，鉴定病原菌难度较大，而且采用传统检测方法难以估测病原菌量，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制，所以传统的检测方法逐步被分子检测技术所取代。近年来，已经开发了许多检测致病真菌的分子方法。DNA探针检测技术很早就被用于研究和开发的植物病原真菌检测。在中国，这项技术也被用于真菌病原体的检测。然而，在实际应用方面，因为核酸探针的制备相对困难，这种技术操作复杂，杂交和标本处理成本昂贵并且耗时。此外，可重复性差，以及可能造成的假阳性或假阴性，都是这项技术可能存在的一些问题。在PCR技术出现以来，已经被证明是一种快速、准确、灵敏、操作简单的检测技术，且被广泛应用于检测植物病原真菌，真菌识别，和系统发育研究等领域。实时定量PCR是美国应用生物系统公司1996年开发的，就有快速、灵敏、准确、定量、可重复性强等优点。这项技术已经成为分子生物学的一个重要工具。然而，考虑到实用性，检测致病真菌需要快速，操作简单，尽可能降低成本，尽量不依赖于昂贵的设备。需要可以在农场或基层这些设备相对落后的单位推广使用。重组酶介导等温扩增(RecombinasePolymerase Amlification，RPA)技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理是利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，RPA技术有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远高于传统的PCR技术，所用时间更短，最短可在5min内实现。由于RPA技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。RPA技术的最大特点是只需要1对引物即可在37℃左右的恒温条件下实现模板核酸的扩增，不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，因此不需要昂贵的仪器设备。而且37℃的常规反应温度很容易满足，适合基层对病原菌的快速检测。目前，RPA技术已经广泛应用于人体、动物或植物上的病毒检测，但在植物病原卵菌的检测方面，尤其是对于栗黑水疫霉的RPA检测，未见相关应用报道。

发明内容