[发明专利]一种基于RPA-侧流层析技术检测栗黑水疫霉的引物和探针组合及其应用

权利要求书

1.一种基于RPA-侧流层析技术检测栗黑水疫霉(Phytophthora cambivora)的引物和探针组合，其特征在于，

所述引物序列为：

正向引物RPA-PcaRPA-F:5’-CCTAGGTCCACCATGGCTAAGTTTTGACCTCCAGG-3’(SEQ ID NO:1)；

反向引物RPA-PcaRPA-R:5’-CACTACAATTCCGAATAATCACAGTGTACACCAGTTAGCT-3’(SEQID NO:2)；

所述探针序列为：PcaRPA-P:5’-TCGTTGTTGTGCCCAGAAAATTCGCACGATGAGCTGGACGGCAAG-3’(SEQ ID NO:3)。

2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述反向引物RPA-PcaRPA-R的5’端添加有Biotin，所述探针PcaRPA-P的5’端添加有FAM，3’端添加有C3-spacer，并标记有四氢呋喃(THF)，标记位置为TCGTTGTTGTGCCCAGAAAATTCGCACGAT-THF-GAGCTGGACGGCAAG。

3.一种基于RPA-侧流层析技术检测栗黑水疫霉(P.cambivora)的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样本DNA；

2)以DNA为模板，进行RPA扩增；其中，正向引物RPA-PcaRPA-F:CCTAGGTCCACCATGGCTAAGTTTTGACCTCCAGG(SEQ ID NO:1)；反向引物RPA-PcaRPA-R:CACTACAATTCCGAATAATCACAGTGTACACCAGTTAGCT(SEQ ID NO:2)；所述探针序列为：PcaRPA-P:TCGTTGTTGTGCCCAGAAAATTCGCACGATGAGCTGGACGGCAAG(SEQ ID NO:3)；所述反向引物RPA-PcaRPA-R的5’端添加有Biotin，所述探针PcaRPA-P的5’端添加有FAM，3’端添加有C3-space，并标记有四氢呋喃(THF)，标记位置为TCGTTGTTGTGCCCAGAAAATTCGCACGAT-THF-GAGCTGGACGGCAAG；

3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测；取5μL的RPA扩增产物直接滴到LFD试纸条的一段，另一段垂直放入100μL of buffer(Milenia Biotec,Germany)，5分钟后观察结果；当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内(Control line)，一条位于检测区(Testline)，则结果为阳性，表明样本中含有栗黑水疫霉(P.cambivora)；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区(Test line)没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有栗黑水疫霉(P.cambivora)。

4.根据权利要求3所述的基于RPA-侧流层析技术检测栗黑水疫霉(P.cambivora)的方法，其特征在于，步骤2)中，RPA扩增：向装有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp反应单元管(TwistAmp Basic kits，Twist)中加入缓冲液Buffer 29.5μL，10μM的上游引物2.1μL，10μM的下游引物2.1μL，探针0.6μL，DNA 2.0μL，MgAc 2.5μL加在PCR管盖内部，去离子水补足至50μL；将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上反应20min。

5.一种基于RPA-侧流层析技术检测栗黑水疫霉(P.cambivora)的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量以上的权利要求1所述的引物和探针组合。

6.根据权利要求5所述的基于RPA-侧流层析技术检测栗黑水疫霉(P.cambivora)的试剂盒，其特征在于，所述引物的终浓度为0.42μmol/L，所述探针的终浓度为0.12μmol/L。