[发明专利]用于分枝杆菌菌种鉴定的寡核苷酸组合、方法及试剂盒

说明书

本发明涉及分子学生物检测领域，更具体的，涉及分枝杆菌鉴定领域。本发明提供了一种寡核苷酸组合，包括检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸，以及检测胞内分枝杆菌的寡核苷酸，可选地还包括选自其余三组中的至少一组，其可特异性地检测结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，并鉴定至具体种/亚种，同时还实现一个通道同时检测两种分枝杆菌，扩大了荧光PCR检测分枝杆菌的数量；本发明还提供了包含该寡核苷酸组合的试剂盒以及用于鉴定分枝杆菌的方法。

技术领域

本发明属于分子学生物检测领域，更具体的，属于分枝杆菌鉴定领域。

背景技术

分枝杆菌(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的，有时有分枝或出现丝状体的菌。分枝杆菌种类较多，主要包括结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)，和非结核分枝杆菌。

结核分枝杆菌(M.tuberculosis，TB)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。

非结核分枝杆菌(none—tuberculous Mycobacteria，NTM)，也曾称为非典型分枝杆菌(Mycobacteria other than tuberculosis，MOTT)。随着医务工作者对相关疾病认识的提高、菌种鉴定技术的进步以及免疫缺陷性疾病和免疫抑制剂使用增多等因素，临床观察到的与NTM相关的疾病呈明显增多趋势。临床对NTM感染疾病诊断和治疗需求的增加促使对临床实验室检验能力要求的不断提升。NTM在肺器官上的感染症状与TB类似。NTM在环境中普遍存在，以土壤和水中最为常见，水源性NTM与人类感染的关系最为密切。随着鉴定技术的进步，已报道的分枝杆菌菌种数量越来越多，目前已超过170种。临床最常见的有临床价值包括脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌以及蟾蜍分枝杆菌等。

目前，常见的分枝杆菌的鉴定方法有三种：生化试验、初步菌种鉴定方法和具体菌种鉴定方法。其中，生化试验虽然曾经是经典方法，但由于操作复杂、耗时而结果不准确，因此已不常使用。初步菌种鉴定方法仅能鉴别MTBC和NTM，具体菌种鉴定方法虽然能够鉴别至种水平，但鉴定的菌种很少，且准确性和灵敏度不高。

荧光定量PCR是一种对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程的检测方法；结合相应的软件可以对产物进行分析，具有反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰的特点。目前已有使用荧光定量PCR鉴定分枝杆菌的报道，例如，中国发明专利(公开号：CN101413031A)公开了一种采用荧光PCR鉴定分枝杆菌的方法以及试剂盒，所述试剂盒包括引物1、2、3、4和探针1、2，能够将结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌区分开。然而，该试剂盒或方法不能将分枝杆菌鉴定到具体种，且无法同时对多个分枝杆菌菌种/亚种进行检测，除此之外也并未对灵敏度以及准确度进行验证。

因此，存在对同时鉴定多个分枝杆菌种/亚种的高灵敏度试剂的强烈需求。

发明内容

有鉴于此，在第一方面，本发明提供了一种寡核苷酸组合，包括：

第一组：检测偶然分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:5、6和19所示，以及检测胞内分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:11、12、23和27所示，可选地还包括选自以下组中的至少一组：

第二组：检测堪萨斯分枝杆菌的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:1、2和17所示，以及检测脓肿分枝脓肿亚种的寡核苷酸，其序列如SEQ ID NO:7、8、21和25所示；