[发明专利]一种辅助生殖培养用油的安全性检测方法

说明书

一种辅助生殖培养用油的安全性检测方法，依据国际通用的1‑细胞胚胎方法进行，MEA是采用小鼠胚胎体外常规培养体系，在1‑细胞小鼠胚胎微滴培养时，加入0.01mg/mL‑0.03mg/mL PVA，代替原来的人血清蛋白或动物血清蛋白，可以明显提高MEA方法检测矿物油潜在毒性，在囊胚率标准不变的情况下，提高本方法的灵敏度，增强了本行业对该类产品的安全性控制。

技术领域

本发明涉及一种辅助生殖培养用油的安全性检测方法，属于生物制品质控和检测领域。

背景技术

体外受精(In Vitro Fertilization)是指人的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。目前，随着社会的发展，人类辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology,ART)正凸显其重要性。人类辅助生殖技术的安全性是关系到其配子以及胚胎的正常发育，临床结果和后代长期健康的重要保证。在胚胎培养过程中，需要用矿物油覆盖培养液滴(50μL-100μL)进行体外胚胎培养。这项技术可用微液滴培养液进行胚胎培养从而进一步增加胚胎对环境的敏感度。同时覆盖矿物油可以隔绝培养液和外部环境，有利于保持培养液pH值、渗透压，温度及湿度的稳定性，防止培养液环境受污染。

目前，最常用的人类卵母和胚胎培养方法是使用培养液液滴加矿物质油覆盖。矿物质油覆盖稳定了培养条件。然而，矿物质油是一种化工产品，其中极微量的芳香烃，不饱和烃带来的有害物质进入胚胎培养系统，影响其正常发育。矿物质油必须在用于临床前需进行质量控制测试，提供有效的风险评估。1-细胞小鼠胚胎测定法(Mouse Embryo Assay,MEA)是国际上最广泛使用的质量测试方法。然而，培养液(培养液滴)中的人或动物血清蛋白有吸附有机有害物质的功能，影响对矿物质油质量的检测。

因此很多矿物油的潜在毒性无法通过常规MEA方法检测出来，申请人通过临床验证，发现现有的MEA方法敏感性仍需进行提升，才能更精确灵敏地对矿物油的安全性进行检测，保证其使用的安全性和可靠性。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种辅助生殖培养用油的安全性检测方法，包括以下步骤：

1)促进雌性小鼠排卵，受精，受精成功后，收集1-细胞小鼠胚胎；

2)去除步骤1)细胞团上的颗粒细胞，收集1-细胞小鼠胚胎；

3)将步骤2)得到的1-细胞小鼠胚胎进行单胚胎的微液滴培养液培养，微液滴培养液中加入聚乙烯醇，分别覆盖待测用油和对照用油，培养后进行囊胚数量和囊胚率的统计。

在上述方法中，申请人创造性的使用了单胚胎的微液滴培养液培养，所述微液滴的体积为10μl-20μl，这属于MEA的非常规操作，常规方法为多胚胎的液滴培养(体积为50μl-200μl)，申请人前期实验证明，基于本方法，采用多胚胎的液滴培养，会显著降低该方法的敏感度检测度(甚至与传统MEA方法敏感度无法区别)。申请人推测为多胚胎培养容易产生相互作用，向环境分泌保护性物质，形成群居效应，提高对恶劣环境的适应度，从而降低整个方法的敏感度。

在上述的安全检测方法，所述雌性小鼠选用5-7周龄小鼠。

在上述的安全检测方法，受精操作包括腹腔注射妊娠母马血清诱导超排卵，48小时后人绒毛膜促性腺激素诱发排卵，雌鼠和雄鼠交配，交配成功验证。

在上述的安全检测方法，去除步骤1)细胞团上的颗粒细胞优选透明质酸酶去除。

在上述的安全检测方法，所述透明质酸酶浓度优选0.5-1.5mg/ml。

在上述的安全检测方法，所述聚乙烯醇浓度为0.01mg/mL-0.03mg/mL。

在上述的安全检测方法，所述液滴培养液为不含血清蛋白(尤其不含人血清蛋白)培养液。