[发明专利]艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组及试剂盒

说明书

本发明公开了一种艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组及其试剂盒，所述引物组由TcdA引物、TcdB引物和GS引物组成；TcdA引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的TcdA上游引物、TcdA下游引物和TcdA探针；TcdB引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的TcdB上游引物、TcdB下游引物和TcdB探针；GS引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的GS上游引物、GS下游引物和GS探针；TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷酸序列的5’端均与荧光基团连接，3’端均与猝灭基团连接，并且TcdA探针、TcdB探针和GS探针三者的5’端分别连接不同的荧光基团。

技术领域

本发明微生物领域，特别是一种用于艰难梭菌荧光定量PCR检测的引物组及试剂盒。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)又称难辨梭菌、难辨棱状芽孢杆菌或困难梭菌，属厌氧性细菌，目前已被公认为是引起抗生素相关性腹泻(AAD)和伪膜性肠炎(PMC)的重要致病菌。除上述疾病外，艰难梭菌尚可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等，近年来该菌已成为医院内感染的病原菌之一。引起临床症状的产毒艰难梭菌，产毒素种类包括毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)和二元毒素(cdtA/cdtB)，其中基础的毒素因子是毒素A和毒素B。目前国内临床诊断艰难梭菌毒素主要采用酶联免疫吸附(ELISA)检测毒素B，或者对疑似样本进行厌氧培养后鉴定，该方法检测时间长，操作比较繁琐，而且检测通量小，不适宜大规模的筛查。此外，由于检测的样本为粪便，含有较多干扰物质，容易造成假阴性等，影响检测的准确性。而针对疑似样本的厌氧培养鉴定的操作更加繁琐，须具备完善的实验条件和对检测的实验水平要求较高，同样不适宜大规模筛查。

荧光定量PCR法检测病原体的应用因其快速、灵敏等优点越来越受医院检验科关注，相应的产品也正迅速更新换代，替代原有的不合时宜的检测方法。福建医科大学硕士论文“多重PCR方法检测艰难梭菌毒素A基因、毒素b基因和二元毒素基因，潘少敏”公开了一种利用PCR检测艰难梭菌的方法并公开了相关的引物，该文献使用的是普通PCR的方法，需要进行琼脂糖凝胶电泳和紫外凝胶成像分析仪下拍照分析，耗费时间，操作繁杂，而且琼脂糖凝胶电泳常用到核酸染色试剂溴化乙锭(EB)是强诱变剂，具有潜在的致癌风险，影响操作者健康；目前针对艰难梭菌运用荧光定量PCR法检测的引物及试剂盒尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术缺陷，提供一种根据目标序列设计特异性的引物组，将产毒素的艰难梭菌DNA目的片段进行扩增，通过多重荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素A(tcdA)和毒素B(tcdB)的检测引物组及试剂盒。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组，所述引物组包括TcdA引物、TcdB引物和GS引物；所述TcdA引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示的TcdA上游引物、TcdA下游引物和TcdA探针；所述TcdB引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的TcdB上游引物、TcdB下游引物和TcdB探针；所述GS引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的GS上游引物、GS下游引物和GS探针；所述TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷酸序列的5’端均与荧光基团连接，3’端均与猝灭基团连接，并且TcdA探针、TcdB探针和GS探针三者的5’端分别连接不同的荧光基团；

上述荧光基团与猝灭基团均为本领域常规的荧光染料基团，所述荧光基团包括但不限于FAM、VIC、ROX、CY5、JOE等基团，猝灭基团包括但不限于TRAMA、BHQ1、BHQ2等基团。