[发明专利]基于RPA的鸡毒支原体的实时荧光检测试剂盒、试纸条检测试剂盒及其用途

说明书

本发明公开了一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的鸡毒支原体实时荧光试剂盒及其用途，同时还提供了一种检测鸡毒支原体的试纸条试剂盒及其用途。这两种试剂盒均根据鸡毒支原体基因MGA_0878序列设计并筛选出一套各自检测的引物及探针组合，虽然两个试剂盒针对同一靶标序列，但是引物和探针的修饰碱基和检测平台不一致。实验证明这两个试剂盒特异性强、灵敏度高，与qPCR的符合率均为100％，不仅为有效检测和鉴定鸡毒支原体提供了技术手段，而且操作简便、快速、成本低，适用于基层兽医现场诊断，也能够用于鸡毒支原体的科学研究。

技术领域

本发明属于预防兽医学检验领域，涉及一种检测鸡毒支原体的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA的快速检测鸡毒支原体的实时荧光试剂盒以及试纸条试剂盒，还涉及二者在检测鸡毒支原体中的用途。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)属于支原体目、支原体科、支原体属，是一种具有高度传染性的能够引起鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类呼吸系统疾病的重要病原体之一。鸡群感染MG后表现为咳嗽、流鼻涕、流眼泪，严重时呼吸困难或张口呼吸；该病发病率高，病程长，造成雏鸡的淘汰率上升和成年鸡的产蛋率下降，在我国几乎100％的鸡场都有感染，严重危害养鸡业的发展；考虑到我国鸡群的养殖模式、商业化MG弱毒苗的安全性及抗生素的耐药性的问题，MG的防治难度越来越大，因此只有对该病进行快速诊断，才能为该病的防控争取时间，最大限度的减少疫病的传播和经济的损失。

目前检测MG的方法包括：支原体的分离培养、血清学抗体检测及分子基因诊断，其中分离培养是诊断支原体感染性疾病的金标准，但支原体对培养基的营养要求高，生长缓慢，分离难度大，只适用于实验室检测；血清学检测如平板凝集试验(SPA)和血凝抑制试验(HI)，这两种方法均涉及制备抗原的菌株来源问题，具有灵敏度低、特异性差、结果判断主观性强和不适合大批量检测等特点，限制了它们在临床中的广泛应用。ELISA诊断法以针对粘附蛋白或热休克蛋白较多，但这些支原体膜相关抗原的某些表位与其它支原体，如模仿支原体相似，容易出现交叉反应和假阳性。如专利CN201110094758.2公开了一种检测MG抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒是以MG粘附素蛋白PvpA为包被抗原建立的MG间接ELISA抗体检测方法，但该方法只针对特定一种动物开发的试剂盒，使用范围窄，不适合其他感染MG的禽类。目前，商业化的MG间接ELISA试剂盒，主要来自美国和欧洲，虽然特异性高，但对不同菌株感染的抗体检测敏感度不同，且价格昂贵，一份血样的检测费用高达11.5元，限制了养殖户的使用，仅限实验室研究用。传统的聚合酶链反应(PCR)和实时荧光定量PCR(real-timePCR)是目前应用最多的分子诊断方法，但是这两种技术都需要昂贵的热循环仪器及熟练的操作人员，费时费力，难以现场进行操作和向基层推广，如孙俊颖等(2015)公开了一种基于SYBR Green I的用于检测MG 16S rDNA的实时荧光定量PCR检测方法，但由于SYBR GreenⅠ非特异性的结合所有双链DNA，因此特异性相对较差，且该方法需要昂贵的硬件设备和专业的操作人员、耗时较长，只适合实验室进行检测；赵杰等(2015)公开了一种检测MG mgc2基因的套氏PCR检测的方法，虽特异性高，敏感性强，但需要用核酸电泳对扩增产物进行检测，增加了污染的可能性且费时费力。

RPA技术是由以英国剑桥Babraham研究院建立的并由Twist Dx生物技术公司发明的(http://www.twistdx.co.uk/)。该技术以T4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有T4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsX和uvsY、单链结合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddH₂O和Mg²⁺等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内DNA复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。目前RPA技术已经在一系列病原微生物的分子检测中得到应用，如结核分枝杆菌、口蹄疫病毒、犬细小病毒、非洲猪瘟等。但据我们所知，国内外未见RPA技术在MG检测中的应用。

发明内容