[发明专利]应用荧光实时定量PCR筛选重组汉逊酵母病毒样颗粒表达株的方法

说明书

本发明公开一种应用荧光实时定量PCR筛选重组汉逊酵母病毒样颗粒表达株的方法：将重组汉逊酵母阳性克隆株接种至液体培养基中，培养至对数期进行诱导表达，对培养物进行采样并提取样品总RNA；使用一步法荧光实时定量PCR对所提取的总RNA进行反转录和特异性扩增，特异性扩增是扩增汉逊酵母肌动蛋白结构基因及构成病毒样颗粒的多个组件蛋白基因；获得各样品汉逊酵母肌动蛋白结构基因及病毒样颗粒的多个组件蛋白基因的扩增循环数，分别记为及，计算与差值比例，取与差值较大且比例与个组件蛋白基因构成病毒样颗粒的比例相近的样品。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种应用荧光实时定量PCR筛选重组汉逊酵母病毒样颗粒表达株的方法。

背景技术

汉逊酵母是一种耐热酵母，最适生长温度为37~43℃，最高生长温度达49℃。它体内含有一种特殊的甲醇代谢途径，此途径是在甲醇氧化酶（MOX）的催化下将甲醇氧化成甲醛和过氧化氢，甲醛可在甲醛氧化酶（FMD）和甲酸脱氢酶的作用下进一步氧化成二氧化碳，也可在二氢丙酮合成酶（DHAS）等的作用下通过木酮糖单磷酸途径生成碳水化合物，成为细胞物质；过氧化氢则在过氧物酶的作用下形成水和氧气。汉逊酵母细胞中，MOX、DHAS和过氧化物贮存于过氧化物体，细胞以葡萄糖为碳源时，过氧化物体的体积约占酵母细胞总体积的1%。细胞以甲醇为碳源时，相关的酶大量合成，过氧化物体急剧膨胀，其体积可达酵母细胞总体积的80%。当汉逊酵母表达外源蛋白时，合成的蛋白质可贮存在过氧化物体中，避免对细胞产生毒害且免受蛋白酶降解。

汉逊酵母表达系统是20世纪90年代发展起来的最为理想的外源基因表达系统之一，具有表达菌株遗传性质稳定、表达量高、生物活性好、培养密度高、生产成本低、适用于工业化大生产等优点，许多难以表达的基因在汉逊酵母中都得到高效表达。汉逊酵母表达系统该系统已成功表达了多个病毒样颗粒疫苗，如乙肝疫苗、戊肝疫苗、HPV疫苗等均获得了较好的表达量。

病毒样颗粒（Virus-Like Particles,VLP）是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒且没有病毒核酸，不能进行自我复制，在形态上与真正病毒例子相同或相似。由于VLP表面能够重复且高密度展示外源性表位从而引发强有力的免疫应答，因此它对于多种疾病来说都是一种可开发理想的疫苗形式。近年来许多VLP疫苗接连面世，其中以Merck公司研制的四价和九价VLP宫颈癌疫苗最为成功。然而，由于不同组件蛋白表达情况的差异，导致不同表达株之间的组装情况千差万别，为此，制备多结构组件蛋白的病毒样颗粒一直是VLP疫苗的瓶颈问题。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种应用荧光实时定量PCR筛选重组汉逊酵母病毒样颗粒表达株的方法。

本发明的技术解决方案是：一种应用荧光实时定量PCR筛选重组汉逊酵母病毒样颗粒表达株的方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 将构建完成的重组汉逊酵母阳性克隆株接种至液体培养基中，培养至对数期加入甲醇进行诱导表达24h，对培养物进行采样并提取样品总RNA；

b. 使用一步法荧光实时定量PCR对所提取的样品总RNA进行反转录和特异性扩增，所述特异性扩增是扩增汉逊酵母肌动蛋白结构基因及构成病毒样颗粒的N个组件蛋白基因；

c. 获得各样品汉逊酵母肌动蛋白结构基因及病毒样颗粒的N个组件蛋白基因的扩增循环数，分别记为及，所述n为1，2，3……N；

d. 按下式计算与差值比例，；取与差值较大且比例与N个组件蛋白基因构成病毒样颗粒的比例相近的样品，即筛选出重组汉逊酵母病毒样颗粒表达株。

本发明可以对多组件蛋白共表达的重组汉逊酵母进行定向筛选，排除掉表达比例偏差过大的转化株，获得可能的最佳表达株，以进行后续的纯化和形态学确定。与传统的Western Blot免疫印迹法相比，不需要大量使用不同组件蛋白的特异性抗体，方便快捷且筛选通量具有显著优势，降低了病毒样颗粒疫苗的研发成本和周期。