[发明专利]一种同步检测TMV、CMV和PVY的三重实时荧光定量RT-qPCR方法

说明书

本发明公开了一种同步检测TMV、CMV和PVY的三重实时荧光定量RT‑qPCR方法。本发明以TMV、CMV和PVY的外壳蛋白保守序列为靶标序列设计得到一组三重实时荧光定量RT‑qPCR引物组合，包括引物组qTMV‑F/qTMV‑R、引物组qCMV‑F/qCMV‑R、以及引物组qPVY‑F/qPVY‑R；其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～6所示。并进一步以该引物组为基础，首次建立了三重实时荧光定量RT‑qPCR方法，能够快速、准确、高效地鉴定和检测TMV、CMV和PVY，检测灵敏度显著高于ELISA和RT‑PCR这两种方法。另外，该方法操作简单、检测灵敏度高、特异性强、稳定性好，易于基层检测单位推广使用，具有广阔的发展空间和良好的实际应用价值。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，更具体地，涉及一种同步检测TMV、CMV和PVY的三重实时荧光定量RT-qPCR方法。

背景技术

烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus，CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是侵染烟草的三种主要病毒。它们引发的病毒病烟株在田间发生病毒病的原因主要有土壤带毒传毒、昆虫传毒、苗期带毒等，其中，烟田土壤带毒传毒是烟草病毒病传播的主要途径之一。造成TMV、CMV和PVY土壤非介体传播的原因主要是TMV、CMV和PVY在烟草病根中的存活期比较长，而且它们极易通过根系的伤口侵入烟株，田间移苗时会使根系产生许多微伤口，土壤病残体中的病毒便会趁机侵入烟苗根部。近年来，烟草病毒病的发生呈上升趋势，严重影响烟叶的品质和产量，导致烟草产业经济损失巨大，使烟农收入减少，降低其种植烟草的积极性。快速、准确地检测烟草上的相关病毒是生产上防控病害、减少损失的重要手段之一。

病毒的常规检测方法有电镜检测、酶联免疫吸附测定(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay，ELISA)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)(如果检测对象是RNA病毒，则为RT-PCR)技术。ELISA操作简便，成本低廉。但是，ELISA检测结果底物溶液的显色反应存在非特异性颜色反应的干扰，可能出现假阳性现象，从而影响该方法的准确性和灵敏度。RT-PCR具有省时、经济、高效等优点。与ELISA相比，它具有更高的灵敏度和更快的检测速度，可以节约大量时间。但是在设置RT-PCR反应程序时要注意退火温度的选择，不合适的退火温度可能引起非特异性扩增或者没有条带，从而影响实验结果的判断。因此，亟需建立一种针对土壤携带病毒的简单、快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的检测方法。

前人对烟田土壤中病原物检测的研究、报道较少。周雪平等用指示指物法和ELISA法检测了土壤中的CMV，证明了CMV可以通过土壤进行非介体传播。刘敏等比较分析了病毒生物学测定、DAS-ELISA、胶体金试纸条检测和RT-PCR等4种方法检测土壤中TMV的灵敏度及特异性。任锡毅等结合实时荧光RT-PCR和试管捕捉RT-PCR法，对实时荧光RT-PCR法加以改进，并在此基础上成功构建了能同时检测TMV和PVY的多重试管捕捉实时荧光RT-PCR检测体系。孙洁等用实时荧光定量PCR建立了检测香蕉中CMV的方法。

TMV、CMV和PVY这三种病毒可严重侵染烟草造成烟草病毒病，影响烟草的产量和品质，但目前国内外还未见有通过实时荧光定量RT-qPCR法定性和定量同时检测TMV、CMV和PVY这三种病毒的报道。因此，为避免更大的经济损失，亟需一种能够同时快速、高效、准确鉴定和检测TMV、CMV和PVY的分子生物学方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种同步检测TMV、CMV和PVY的三重实时荧光定量RT-qPCR方法。本发明主要的创新点在于针对烟草上的TMV、CMV和PVY，开发一种能够快速、高效、准确鉴定和检测上述三种病毒的三重实时荧光定量RT-qPCR方法，以利于在基层检测单位中推广使用。