[发明专利]简单节杆菌与基因工程酵母菌株顺序转化制备宝丹酮

说明书

本发明涉及一种甾体类药物的生产方法，具体涉及利用简单节杆菌与基因工程酵母菌株顺序发酵制备宝丹酮甾体化合物的方法。本发明首先提供一株能高效表达17β羰基还原酶的毕赤酵母基因工程菌株，其次利用上述毕赤酵母基因工程菌，提供一种微生物顺序转化发酵化合物AD制备化合物BD的方法，该方法是将AD先经简单节杆菌发酵后，将反应体系灭活，再经毕赤酵母基因工程菌株顺序发酵制备化合物宝丹酮。

技术领域：

本发明涉及一种甾体类药物的生产方法，具体涉及利用简单节杆菌与基因工程酵母菌株顺序发酵制备宝丹酮甾体化合物的方法。

背景技术：

宝丹酮(BD)又名勃地酮，是一种白色或类白色结晶性粉末，其分子式为C₁₉H₂₆O₂。宝丹酮是睾酮的衍生物，因此继承了睾酮的大部分性质，具有雄性激素能力和蛋白质合成能力。宝丹酮能使肌纤维细胞的氮平衡状态随时保持趋于正向，使肌纤维细胞加速合成蛋白质，肌纤维细胞因此而扩张膨胀，对体能锻炼者增强肌肉和耐力有很大功效。长期以来，宝丹酮的原料生产企业在国内并不多，且多为化学法合成。化学法因其生产步骤繁琐、涉及有毒有害试剂的使用、高污染等问题，不利于工业大规模生产。因此，如何通过生物合成途径来替代化学合成方法，并建立高效的生物合成策略，是目前亟待解决的关键性问题。

近年来，研究者在通过微生物转化法合成宝丹酮的相关研究多集中于利用单一菌株进行催化，且其催化过程依然存在底物投料浓度低、转化效率不足等问题。虽然Mucorracemosus,Nostocmuscorum,Arihrobacteroxydans等微生物，都能够以雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)为底物，通过17β羰基还原作用生产BD，但是它们中很少有微生物能够直接以价格相对低廉的雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为底物合成BD。AD是合成ADD的前体物质，AD经3-甾酮-△1-脱氢酶(KsdD)的C1,2位脱氢作用可以合成ADD，ADD再经17β羰基还原作用生成目的产物BD。虽然已有研究将真菌来源的KsdD蛋白于毕赤酵母中外源表达可以获得产物BD，但由于毕赤酵母自身的17β羰基还原作用不够强，因此其底物投料量及BD产量并不高。

目前为止，还未发现有微生物同时具有较强的C1,2位脱氢作用及较强的17β羰基还原作用。简单节杆菌(Arthrobacter simplex)因为转化效率高、反应速率快等优点，已成为工业生产中广泛使用的甾体C1,2脱氢反应菌株；而酵母来源的17β羰基还原酶具有较强的17β羰基还原作用。目前，尚未有利用简单节杆菌和酵母菌株进行联合发酵生产BD的相关研究。

发明内容：

为解决上述问题，节约成本并提高产品收率，本发明首先提供一株能高效表达17β羰基还原酶的毕赤酵母基因工程菌株，其次利用上述毕赤酵母基因工程菌，提供一种微生物顺序转化化合物AD制备化合物BD的方法，该方法是将AD先经简单节杆菌发酵后，将反应体系灭活，再经毕赤酵母基因工程菌株顺序发酵制备化合物宝丹酮。

所述毕赤酵母基因工程菌株，是在毕赤酵母宿主细胞中过表达17β羰基还原酶编码基因所述的；

优选地，所述毕赤酵母宿主细胞为毕赤酵母GS115；

优选地，所述17β羰基还原酶(GenBank编号为：KZV10489.1)编码基因为ayr1基因，Gene ID:854682；

优选地，所述毕赤酵母基因工程菌株为毕赤酵母(P.pastoris)GS115AYR1_S.c，是通过在毕赤酵母GS115中通过质粒pPIC3.5K表达Gene ID:854682所示的ayr1基因所得；

所述微生物顺序转化发酵化合物AD制备化合物BD的方法具体如下：