[发明专利]二氯罗丹明染料的合成方法及其应用

说明书

本发明公开了二氯罗丹明染料的合成方法及其应用，以及制备式(I)和式(II)所示化合物的方法。该方法包括：将式(I‑a)所示化合物与式(I‑b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物。该方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料。

技术领域

本发明涉及有机合成领域，具体地，本发明涉及二氯罗丹明染料的合成方法及其应用。

背景技术

罗丹明是一类典型的氧杂蒽类化合物。罗丹明类染料是指以罗丹明为母体，经过官能团修饰得到的一系列染料衍生物。该类染料具有光稳定性好、对pH不敏感、荧光量子产率高，较宽的波长范围以及化学合成和修饰简单等优点，是一种重要的荧光小分子染料探针，广泛应用于生物样品的染色与荧光标记中，也广泛的应用于分析化学领域。

二氯罗丹明化合物与典型的罗丹明染料类似，它作为一种能量转移荧光染料已经在多篇文献和专利中有所描述，主要应用于分子生物学、细胞生物学和分子遗传学。例如，用来标记脱氧核苷酸、二脱氧核苷酸、多核苷酸，测定DNA序列及碎片分析，是一类用于多重检测的荧光染料；还有一些作为荧光标记可以附着在用荧光磷酸化试剂合成的新生或完整的寡核苷酸链上制作成商业化试剂。以上的所有应用都基于可以得到高纯度、单一的目标罗丹明染料，但现有文献和专利都没有其具体的合成及纯化方法。

ABI公司在Sanger法测序的基础上进一步开发出荧光标记的双脱氧法测序试剂盒，即BigDyeTM试剂，接着再结合毛细管电泳，产生了ABI3730和ABI3500等非常成功的测试仪器，主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999％。基于Sanger原理的毛细管电泳法的ABI3730，ABI3500以及其必须的BigDye测序试剂，仍是业内公认的超高精度测序的黄金标准。

BigDyeTM试剂包括Acceptor Dye、连接链(Linker)、ddNTP三部分组成，以ddTTP-Linker-dTMRA为例，该路线中Acceptor Dye(二氯罗丹明染料)是dTMRA，简要合成方法是3-二甲氨基苯酚和3,6-二氯-1,2,4-偏苯甲酸酐在多聚磷酸里加热到180-190摄氏度，经过酸洗，水洗得到的产物性状差，纯度低，并不利于其后期的反应和应用。

另外还有一些报道，罗丹明类荧光染料典型制备方法是通过合适的氨基酚与各种苯甲酸、邻苯二甲酸、苯酐、磺基苯甲酸及其酸酐反应，用浓硫酸、无水氯化锌及其他Lewis酸作催化剂缩合，由于分子结构中含有共轭π键和较活泼的助色基团，通过引入不同的官能团对罗丹明的结构进行修饰，可以设计合成出许多罗丹明类衍生物。但受限其产率不高，不容易得到高纯度、单一的目标罗丹明染料而不适用于大量的合成，使其应用也收到很大局限。

因此，开发一种简单、高收率的合成二氯罗丹明类化合物的方法迫在眉睫。

发明内容

现有技术中，以BigDyeTM试剂目前的合成方法为例，Acceptor Dye(二氯罗丹明染料)作为一种关键荧光试剂，在文献报道中的反应过程较复杂、产率极低、分离纯化难度较大且条件苛刻，得到的不是干净且单一的产物，不能够用于大量的合成。

基于上述问题的发现，发明人提出了一种简单的、快速的、高效的合成二氯罗丹明染料的方法以及纯化方法，该方法可以实现原子经济性高，操作简便，低成本，易于大规模生产的目标，也为后续的反应提供了高纯度的原料，消除不必要的影响因素，如大大提高BigDye^TM试剂合成的成功率。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种制备式(I)和式(II)所示化合物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将式(I-a)所示化合物与式(I-b)所示化合物进行傅克酰基化反应，以便获得式(I)和/或式(II)所示化合物，