[发明专利]结核分枝杆菌核糖体蛋白S7的表达纯化、晶体结构及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体为结核分枝杆菌核糖体蛋白S7的表达纯化、晶体结构及其应用。本发明的蛋白S7含156个氨基酸，分子量约为17.6kDa，等电点约为10.56；在表达菌株Escherichia coli Rosetta(DE3)中具有高度可溶性表达，且纯度及均一性较好。所述核糖体蛋白S7通过X射线衍射的方法获得其三维结构，分辨率达到1.80Å，空间群为P2₁2₁2₁。该结构整体上由6个α螺和2个β折叠组成，其中，由α螺旋1‑α螺旋5组成的α螺旋束结构与其他核糖体上的其他蛋白具有相互作用，而连接在α3与α4之间的β发卡结构具有RNA识别的功能。该核糖体蛋白S7的三维结构在新型抗结核药物筛选中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于结核病致病菌结核分枝杆菌的核糖体蛋白的表达纯化、晶体结构及其在新型抗结核药物筛选中的应用。

背景技术

结核病(Tuberculosis)在中医上称之为瘰疠，是一类由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的传染性疾病，以肺部感染最为常见，身体的其它部位也会感染。大多数的结核病感染为潜伏性结核(latent tuberculosis)，这类感染者仅携带结核分枝杆菌，并不会表现出任何症状。约有5-10％的潜伏性结核会转变为活动性结核(active tuberculosis)。结核病广泛分布于世界各地，据世界卫生组织统计，全球约有四分之一的人口患有潜伏性结核病。仅2017年，全球1000万例新生结核病患者，并导致了130万人死亡。结核病地区分布差异较大，大多来自发展中国家，其中印度、中国、印度尼西亚、菲律宾、巴基斯坦、尼日利亚、孟加拉国和南非这八个国家的新生病例占全球总数的三分之二左右。目前结核病的治疗主要依赖于抗生素，市面上最常用的抗结核药物为利福平(Rifampicin)和异烟肼(isoniazid)，但普遍存在治疗周期长这一缺点，通常需要6个月以上才可能使患者转入稳定期。今年来，由于抗生素的滥用，使得很多致病菌具有多重耐药性，这类耐多药结核病只能通过二线抗结核药物进行治疗，具有很多局限性，如疗效差、副作用大及价格昂贵等，而且大多数情况下需要长期化疗(两年及两年以上)。由于部分广泛耐药结核病对最为有效地几种二线抗结核病药物具有抗性，目前没有很好的治疗方法，导致这类病人无药可医。中国是结核病高负担国及耐多药结核病最多的国家之一，面临着患病人数多、耐多药结核病发现率低、病原学确诊率低和耐药率高等挑战，急需补充药物对抗结核病。

核糖体(Ribosome)作为一种细胞器广泛存在于生命体中，是蛋白质合成的重要场所。蛋白质翻译过程主要可以分为起始、延伸、终止和再循环四个阶段，在这个过程中还需要很多调节因子的参与。尽管原核生物与真核生物核糖体都是由大小两个亚基及核糖体RNA组成，且具有相似的核心区域，但由于其整体结构及参与翻译的调节因子的动态调控机制不同，因此致病菌的核糖体经常用作抗菌药物筛选的直接或间接靶点。S7为核糖体小亚基的组成蛋白，其功能的缺失会直接影响到核糖体小亚基的装配及RNA识别。在之前的研究中发现，结核分枝杆菌的S7蛋白还与链霉素(streptomycin)的抗性有关。本发明通过异源表达及纯化获得了纯度及均一性较好的结核病致病菌Mycobacterium tuberculosisH37Rv^T的核糖体蛋白S7，并利用结晶的方法得到了S7的蛋白晶体并解析了其三维结构。核糖体蛋白S7的晶体结构可在抗结核药物筛选及新药开发等方面具有广泛的前景应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于结核病致病菌的核糖体蛋白的表达纯化方法、其晶体结构和应用。

本发明包括提供对来源于结核病致病菌Mycobacterium tuberculosis H37Rv^T的核糖体蛋白S7进行基因工程改造以获得在大肠杆菌中的高效表达、纯化和结晶的方法，以及所述核糖体蛋白S7的第1位到第156位氨基酸的三维晶体结构及其应用。