[发明专利]用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA及质粒DNA和体外转录方法在审
| 申请号： | 201910198850.X | 申请日： | 2019-03-15 |
| 公开（公告）号： | CN109868288A | 公开（公告）日： | 2019-06-11 |
| 发明（设计）人： | 张力;李政 | 申请（专利权）人： | 张力;李政 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22;C12N15/66;A01K67/033 |
| 代理公司： | 北京思创大成知识产权代理有限公司 11614 | 代理人： | 高爽 |
| 地址： | 102200 北京市昌*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 转录 模板DNA 果蝇 体外转录 质粒DNA 转基因 表达载体 基因工程 碱基序列 模式动物 基因 应用 优化 | ||
1.一种用于果蝇CRISPR转基因的cas9转录模板DNA，其特征在于，该cas9转录模板DNA具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。
2.一种用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其特征在于，该质粒DNA包括以下元件：
cas9转录基因，所述cas9转录基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列；
第一40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因起始密码子ATG之后，cas9转录基因之前；
第二40-nls入核信号，位于所述cas9转录基因中止密码子之前，cas9转录基因之后；
Kozak序列，所述Kozak序列位于所述起始密码子ATG之前；
T7启动子；
sv40-3UTR，所述sv40-3UTR位于所述终止密码子之后；
限制性酶切位点，所述限制性酶切位点位于所述sv40-3UTR之后。
3.根据权利要求2所述的用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其中，所述限制性酶切位点为Xba I酶切位点。
4.根据权利要求2所述的用于果蝇CRISPR转基因的质粒DNA，其中，所述质粒DNA具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列。
5.权利要求1所述的cas9转录模板DNA和权利要求2-4中任意一项所述的质粒DNA中至少一种的应用。
6.一种cas9mRNA体外转录方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将权利要求2-4中任意一项所述的质粒DNA进行扩增和酶切线性化，并将得到的线性化模板进行纯化；
(2)将步骤(1)得到的纯化后的模板进行体外转录和纯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(1)中，所述纯化的步骤包括：采用蛋白酶K加SDS将酶切体系的内切酶去除，然后通过乙醇沉淀。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述体外转录中GTP的用量为20-50mM。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，该方法包括：对cas9mRNA的浓度进行检测，所述检测方法为电泳比对法。
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