[发明专利]一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法

说明书

本发明公开了一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法。通过质粒构建以及融合标签的使用，能够在细胞的胞液中的到大量的可溶性异戊烯基转移酶NovQ，之后经过一步纯化可以得到高活性的蛋白，提高了蛋白获取的效率。利用融合标签与NovQ蛋白共表达可以在不破坏酶结果的前提下得到纯度较高的酶蛋白。本发明相较于其他异戊烯基转移酶获取方法而言，有产量高，酶的提取和纯化方法简单等优势，在萜类的体外和体内生产过程中有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法，特别涉及一种大肠杆菌中可溶性表达芳香族异戊烯基转移酶NovQ的方法以及其在生产维生素K2中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

可溶性芳香族异戊烯基转移酶（soluble aromatic prenyltransferase）是很多生物合成过程中的关键酶，催化芳香族底物的异戊烯基化，进而形成多级代谢产物。可溶性异戊烯基转移酶的底物范围很广，如4-羟基苯丙酮酸，白藜芦醇和对香豆酸都可以被异戊烯基化，进而生成诸多有生理和药理活性的产物。

近年来，国内外对于放线菌来源的ABBA可溶性异戊烯基转移酶的研究报道较多，它们拥有相似的(N/D)DxxD结构，在制药学和理论医学上拥有广泛的应用。Florence Pojer等人（F. Pojer, E. Wemakor, B. Kammerer, H. Chen, C.T. Walsh, S.M. Li, L.Heide, CloQ, a prenyltransferase involved in clorobiocin biosynthesis, ProcNatl Acad Sci U S A, 100 (2003) 2316-2321）将链霉菌来源的CloQ在大肠杆菌中表达，获取可溶性的纯酶进行体外催化，可以得到多种异戊烯基化的产物，如新生霉素。该法使用了GST作为融合标签，但蛋白的表达量受限，且纯化手段较繁琐，得到的目标蛋白活性不高。

随着基因工程技术的发展，大肠杆菌已成为一种常见的异源表达菌株，它具有培养成本低，重组蛋白产量高，易于处理等明显的优势。然而，大肠杆菌表达系统存在一些缺点，例如，高水平的蛋白表达和不适当的表达条件将导致蛋白质的聚集和沉降，从而形成无活性的包涵体。将融合标签连接到重组蛋白的N末端是另一种增强目标蛋白溶解度的方法。通过将靶蛋白引导至细胞质或周质空间的特定位点，融合伴侣可以促进这些蛋白质的正确折叠。常用的融合标签包括麦芽糖结合蛋白（MBP），硫氧还蛋白（TrxA）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）。

MBP是一种由malE基因克隆的融合蛋白，它可以准确定位周质空间，进而促进目标蛋白形成正确的二硫键，阻止其聚集形成包涵体。此外，通过添加相应的蛋白酶，MBP标签可以在目标蛋白纯化后被切割掉，从而可以保持目标蛋白的原始活力，提高蛋白的回收率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达芳香族异戊烯基转移酶的方法及生产维生素K2的方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种表达芳香族异戊烯基转移酶的方法，包括下列步骤：

步骤1：根据NCBI中查找到的MBP的序列，去掉终止密码子，在两端引入NcoI和HindIII两个酶切位点，设计得到引物，然后进行PCR扩增得到第一MBP片段；

步骤2：根据NCBI中查找到的MBP的序列，保留终止密码子，在两端引入NdeI和KpnI两个酶切位点，设计得到引物，然后进行PCR扩增得到第二MBP片段；

步骤3：使用限制性内切酶切割第一MBP片段和质粒pET28a，清洁回收后利用T4连接酶将第一MBP片段和质粒pET28a连接起来，得到载体pET28a-MBP；使用限制性内切酶切割第二MBP片段和质粒pETDuet-1，清洁回收后利用T4连接酶将第二MBP片段和质粒pETDuet-1连接起来，得到载体pETDuet-1-MBP；