[发明专利]一种大量扩增NK细胞的方法

说明书

本发明涉及一种大量扩增NK细胞的方法，属于生物技术领域，首先制备外周血单个核细胞，然后将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin、美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL‑2、IL‑15、IL‑18和自体血浆的培养基中，37℃、5％CO₂的条件下培养3d后，用含有IL‑2、IL‑15、IL‑18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2‑3×10⁶个细胞/mL，37℃、5％CO₂的条件下培养10‑16d，即得大量的NK细胞。本发明解决了现有技术中无法扩增更大数量NK细胞的问题，该方法操作简单，容易实现，扩增效率高，可以获得更高数量的NK细胞以供临床回输，并且细胞纯度高。

技术领域

本发明涉及一种大量扩增NK细胞的方法，属于生物技术领域。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是先天免疫淋巴细胞的关键子集，是天然免疫的重要组成部分，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。NK细胞占外周血淋巴细胞的10％-15％，可以向外周组织和次级淋巴器官(SLO)迁移，或者在外周血和SLO之间形成再循环。通过这种再循环方式，NK细胞可以巡视身体，并在特定的地点遇到不同的免疫细胞，发生调节作用。

目前的培养体系是能够培养出对肿瘤细胞杀伤性很高的NK细胞，但增殖数量还不够满意。重组细胞因子IL-2和IL-15可以通过与NK细胞表面的多聚蛋白体受体的结合而刺激细胞活化、增殖。然而，在培养基中仅添加IL-2、IL-15只能使NK细胞扩增几十倍，并且通常需要饲养层细胞共同培养，操作复杂，细胞得率低。虽然目前有很多改进NK细胞扩增培养的方法，但仍存在细胞纯度低、扩增效率不高等问题。

RetroNectin属于重组人纤维连接蛋白片段(FN)，它含有人纤维连接蛋白CS-1位点和central cell-binding domain，分子量约为63K，其生理活性为参与细胞的附着、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-1site及central cell-binding domain可与T细胞表面的VLA结合，从而刺激细胞大量繁殖。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中无法扩增更大数量NK细胞的问题，提供一种大量扩增NK细胞的方法，该方法可以获得更高数量的NK细胞以供临床回输。

本发明所采用的技术方案是：

一种大量扩增NK细胞的方法，包括如下步骤：

(1)收集血浆：取外周血，离心分离后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆灭活后离心，收集上清，用于后续细胞培养；

(2)制备外周血单个核细胞：用生理盐水悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离并用生理盐水洗涤后，获得外周血单个核细胞；

(3)大量NK细胞的诱导：将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin、美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基中，37℃、5％CO₂的条件下进行培养；

(4)大量NK细胞的扩增：步骤(3)中培养2-4d后，用含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-3×10⁶个细胞/mL，37℃、5％CO₂的条件下培养10-16d，即得大量的NK细胞。

进一步，步骤(1)中，灭活温度为56℃，时间为30min。

进一步，步骤(1)中，两次离心的转速均为2000-3000rpm，离心时间均为8-10min。