[发明专利]一种大量扩增NK细胞的方法在审
| 申请号： | 201910174417.2 | 申请日： | 2019-03-08 |
| 公开（公告）号： | CN109679904A | 公开（公告）日： | 2019-04-26 |
| 发明（设计）人： | 崔久嵬;李赵志;牛超;李薇;高千惠 | 申请（专利权）人： | 吉林大学第一医院 |
| 主分类号： | C12N5/0783 | 分类号： | C12N5/0783 |
| 代理公司： | 南京业腾知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 32321 | 代理人： | 郑婷 |
| 地址： | 130021 *** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 扩增 外周血单个核细胞 自体血浆 培养基 抗体 生物技术领域 细胞 扩增效率 细胞纯度 美罗华 回输 鼠抗 制备 接种 | ||
1.一种大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)收集血浆：取外周血，离心分离后，上层为血浆，下层为血细胞沉淀，将血浆灭活后离心，收集上清，用于后续细胞培养；
(2)制备外周血单个核细胞：用生理盐水悬起步骤(1)中得到的血细胞沉淀，得到细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离并用生理盐水洗涤后，获得外周血单个核细胞；
(3)大量NK细胞的诱导：将外周血单个核细胞接种到含有RetroNectin、美罗华抗体、鼠抗人CD161抗体、IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基中，37℃、5％CO2的条件下进行培养；
(4)大量NK细胞的扩增：步骤(3)中培养2-4d后，用含有IL-2、IL-15、IL-18和自体血浆的培养基调整细胞密度至2-3×106个细胞/mL，37℃、5％CO2的条件下培养10-16d，即得大量的NK细胞。
2.如权利要求1所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，灭活温度为56℃，时间为30min。
3.如权利要求1所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，两次离心的转速均为2000-3000rpm，离心时间均为8-10min。
4.如权利要求1所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述培养基的组成为：20-100μg/mL RetroNectin、50-250ng/mL美罗华抗体、0.5-5μg/mL鼠抗人CD161抗体、100-1000U/mL IL-2、1-20ng/mL IL-15、1-10ng/mL IL-18和5-10％自体血浆。
5.如权利要求1所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述接种量为：外周血单个核细胞在培养基里的细胞密度为2-5×106个细胞/mL。
6.如权利要求1所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述培养基的组成为：100-1000U/mL IL-2、1-10ng/mL IL-15、1-10ng/mL IL-18和5-10％自体血浆。
7.如权利要求1至6任一项所述大量扩增NK细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中，培养期间，每2d根据细胞密度0.8-1×106个/mL进行补液。
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