[发明专利]一种C反应蛋白的浓度检测方法

说明书

本发明公开了一种C反应蛋白的浓度检测方法，包括S1、搭建具有三明治结构的金纳米颗粒‑核酸适配体‑磁球生物传感器；S2、将待测C反应蛋白投入到生物传感器的缓冲液中进行反应，使C反应蛋白将生物传感器上的金纳米颗粒置换到缓冲液中；S3、反应结束后，提取缓冲液中的金纳米颗粒在暗场显微镜下观察并计数；S4、根据预先得到的C反应蛋白浓度与金纳米颗粒数量的对应关系，得到待测C反应蛋白的浓度；其中，该对应关系通过如下方式得到：利用多组已知浓度的C反应蛋白样品分别与生物传感器形成多个实验组进行反应后，对每组分别执行S3，并采用数值拟合方法对C反应蛋白样品的浓度与对应的置换下来的金纳米颗粒数量进行曲线拟合，得到该对应关系。

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，尤其是涉及生物传感器构建及其应用领域，具体涉及一种C反应蛋白的浓度检测方法。

背景技术

暗场显微镜技术是利用斜射照明法阻挡透过标本细节的直射光，以反射光和衍射光来观察标本，普通显微镜下可以看到0.45um的细节，而暗场显微镜下能看到0.2～0.004um的极微小物体。金纳米颗粒易于制备，无毒性，具有良好的生物相容性，其包括金纳米球、金纳米棒、金纳米片等形式，可应用于生物检测方面，其强散射特性会随着尺寸形貌的不同发生极大变化，利用这种特性可以在暗场显微镜下特异性地识别特定尺寸特定形貌的金纳米颗粒。

核酸适配体是指利用指数富集进化技术(SELEX)从特定的寡核苷酸库中筛选出能与靶分子特异性结合的寡核苷酸单链。核酸适配体的首次体外筛选是由Tuerk等在1990年建立的体外寡核苷酸筛选，从带有8个随机序列的RNA文库中筛选出和噬菌体T4DNA聚合酶特异性结合的核酸序列。此后，核酸适配体已成熟发展为新一代靶分子特异性识别结合体，可以是单链DNA，也可以是RNA，一般由几十个核苷酸(20～80nt)组成。与蛋白质靶标结合的核酸适配体通过自身折叠形成的二、三级结构，如茎、凸环、发夹、G-四联体、假结体和四角环等，能够与蛋白质靶标的空间结构相匹配，实现高亲和力、高特异性的结合。

人类C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是指在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)。CRP是炎症和心血管疾病的警示因子，故CRP的检测在体外活检领域也受到了越来越多的重视。目前CRP的检测方法主要有免疫比浊法、散射法、免疫分析法等，这些方法样品前处理比较复杂、操作过程繁琐费时，有的需要大型仪器且价格昂贵。另有一些文献提到基于核酸适配体的检测方法，可提升测试体系的灵敏性和特异性，同时可降低被检物的检测下限，但这些方法仍存在一定的缺陷：一方面，通常要让核酸适配体和抗体联用，但抗体具有需体内筛选、稳定性较差、易于失活等缺点，这便会大大增加检测成本以及测试过程和结果的不稳定性；另一方面，这些文献中提到的单独采用核酸适配体检测的方案，其所使用的为RNA核酸适配体，RNA易于失活降解，不易于实际检测。即便有的文献提到采用DNA核酸适配体，但其检测所使用的仪器也较为昂贵，并且样品预处理较为复杂，操作过程繁琐。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日前已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提出一种C反应蛋白的浓度检测方法，通过采用核酸适配体搭建一个操作便捷、灵敏度高的生物传感器来检测C反应蛋白，提高了检测方法灵敏度和特异性的同时，降低了检测成本以及待检物的检测下限。

本发明为达上述目的提出以下技术方案：