[发明专利]一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用

说明书

本发明公开了一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用，单链分子标签接头，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基“U”，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构；本发明通过单链DNA建库，解决现有检测技术中对液态活检特别是ctDNA片段短、浓度低、碎片化、灵敏度低技术问题；实现准确辨别基因组坐标始末位点相同的测序reads是来自同一还是多个原始细胞释放出来的cfDNA，并将来源于同一个细胞的原始正负链的测序reads配对起来分析的目的，从而降低测序的重复劳动，提高对假阳性突变的分辨率。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用。

背景技术

血浆游离DNA又称cfDNA(cell free DNA)，是指外周中游离于细胞外的DNA，cfDNA的来源既包括正常细胞，也有异常细胞(如肿瘤细胞)或者外源的微生物(如病毒DNA)，具体包括自身正常细胞代谢的凋亡小体，肿瘤细胞碎片，外泌体等。

循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA)ctDNA是指外周循环血中含有多种与癌症相关的突变基因，主要由肿瘤细胞脱落或凋亡后释放出而进入循环系统的DNA。ctDNA来自肿瘤细胞本身，是一种高度灵敏、特异性的特征性肿瘤生物标志物，可通过对其进行基因检测，进行定性、定量以及动态追踪观察肿瘤中发生突变的基因，从而为患者治疗前肿瘤分子分型、靶向治疗决策、治疗过程中肿瘤动态和负荷变化评估，以及实时监测治疗有效性等方面提供有效信息。来自宾夕法尼亚大学Abramson癌症中心的研究人员发现，与单独的实体组织NGS 检测相比，NGS液体活检能够识别出更多的非小细胞肺癌突变，帮助临床发现更多患者的靶向突变。在检测的靶向突变数量上，液体活检几乎是单独组织活检的两倍。此外，研究结果还表明，通过液体活检检测出靶向突变的患者，对靶向治疗的反应良好，86％的患者完全反应或部分反应，或保持稳定状态。“实体组织活检仍然是准确诊断的关键，但是我们现在已经证明，液体活检项目可以增加诊断价值，而且当实体组织活检无法进行时，它可以作为一种可行的替代方法”，研究作者Carpenter说道，“鉴于靶向治疗的快速发展，液体活检应该被纳入常规护理标准。”

然而，精确测序ctDNA存在三个巨大的技术障碍：首先是血浆中的ctDNA含量极低，且多为小片段分子特点，部分为受损伤的双链DNA和单链DNA，导致提取较为困难，损失量大，检测灵敏度较低，因此限制了其在临床上的应用。其次是由于后续的建库过程中经过末端修复、腺苷酸化、加接头以及PCR扩增等多步骤后，样本会损失更多，进一步限制了检测灵敏度，因此增加每步实验的效率对提高ctDNA的检出灵敏度都至关重要。最后，基于PCR方法的特意扩增或捕获，随着测序深度的提高而存在大量背景噪音，已严重限制了靶向测序技术在更高数据精度要求的检测。

对于某些低丰度，损伤的双链DNA和单链DNA的检测，以这些额外单链DNA作为模板的话可以显著增加目标DNA的模板量，有利于最终目的DNA捕获。Gansauge,M T等发明了一种单链DNA建库，该方法在单链模板和单链接头的连接步骤，使用的为Circ连接酶II。该方法解决的这种短片段易降解的古生物DNA的建库问题，但连接效率为较低，需要较长的连接时间，成本高。于是他们后续进行了优化，推出新版本ssDNA2.0，其更换了接头引物，同时将Circ连接酶II用常规的T4 DNA连接酶替换，模板用量降低、文库产量和富集度都有扩高，其成本降低近7倍。从建库的效率上来讲，单链建库建库要高很多，相对于基于454平台的双链建库效率要高6倍左右，测序深度高1.9倍左右。

ctDNA含量非常少，以10ml外周血为例，从中可以提取到cfDNA含量约30ng，ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％计算,只有约300pg，也就是大约45个细胞裂解的DNA量，实际情况下，如果是做早期筛查，ctDNA的含量可能相当于5000个细胞中只有1-2个细胞是肿瘤细胞，所以对检测方法的敏感性要求非常高。