[发明专利]一种单链分子标签接头及单链DNA建库方法及其在检测循环肿瘤DNA中应用

权利要求书

1.一种单链分子标签接头，其特征在于，包括：14个碱基配对形成的茎结构、测序引物序列、和8个随机核苷酸组成的分子标签序列，其中测序引物序列与茎结构序列之间插入了一位碱基为“U”脱氧尿嘧啶核苷，该单链核酸序列经退火变性会形成茎环结构。

2.一种单链DNA建库方法，其特征在于，包括如下步骤：

3’末端接头的制备；

5’末端接头的制备；

样本核酸在磷酸酶的作用下去磷酸化及变性处理：高温处理，将原来双链的DNA变性为单链DNA；

3’端接头连接：将单链DNA产物和3’端双链DNA接头进行碱基配对，并头进行连接反应；

3’端接头连接链霉亲和素：将连接反应得到的连接产物通过链霉亲和素磁珠进行吸附，固定在链霉亲和素磁珠上；

延伸：将连接过链霉亲和素的单链连接产物为模板，将3’末端接头作为引物进行延伸，获得双链DNA产物；

5’端接头连接：将双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；

链霉亲和素清洗及文库洗脱回收。

3.根据权利要求2所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，

3’末端接头的制备的具体过程如下：

制备PCR试剂，PCR试剂的配方包括：

用移液器将PCR试剂混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：

95℃ 1min，

95℃-10℃ -0.1℃/sec，

10℃ 5min。

4.根据权利要求3所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，

所述上链序列采用CL78(SEQ ID NO.1)，序列为：

5’Pho-AGATCGGAAG[C3Spacer]10-TEG-biotin3’，该接头序列5’端磷酸化修饰，3’端生物素化修饰，中间引入10个C3相隔臂和TEG分子；

所述下链序列采用CL93(SEQ ID NO.2)，序列为：

5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC7 3’，该接头序列5’端采用amino linker C12修饰，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C7修饰；

所述下链序列采用CL106(SEQ ID NO.3)，序列为：

5’AmC12-AACTTCCGATCTNNNNNN-AmC3 3’，3’端含有6个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C3修饰；

所述下链序列采用CL110(SEQ ID NO.4)，序列为：

5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；

所述下链序列采用CL136(SEQ ID NO.5)，序列为：

5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有7个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰；

所述下链序列采用CL137(SEQ ID NO.6)，序列为：

5’SpacerC12-AA[SpacerC12]CTTCCGATCTNNNNNNNN-AmC6 3’，5’端和中间含有aminolinker C12修饰，3’端含有8个随机核苷酸组成简并碱基，且末端amino linker C6修饰。

5.根据权利要求2所述的一种单链DNA建库方法，其特征在于，

5’末端接头的制备的具体过程如下：

PCR试剂包括：

用移液器将PCR试剂混匀，瞬时离心将样品收集至管底，再将样品置于PCR仪中，PCR程序如下：

95℃ 1min，

95℃-14℃ -0.1℃/sec，

14℃ 5min。